The Protein Physics Lab
To main page

Отчёт за 2002 год


1. При исследовании кинетики денатурации и ренатурации карбоангидразы B в области перехода, инициируемого гуанидингидрохлоридом, обнаружены неизвестные ранее быстрые стадии, скорости которых не зависят от конечной концентрации денатурата. Предполагается, что эти стадии отражают быстрое разрушение (при денатурации) или быстрое формирование (при ренатурации) гидрофобного ядра белка. Этот результат даёт возможность исследовать один из наименее изученных процессов в формировании нативной структуры белка.

Аннотация. Карбоангидраза В является большим (29 kDa) однодоменным белком, процесс формирования нативной структуры которого in vitro проходит по стадийному механизму с накоплением нескольких промежуточных состояний  различной степени структурированности. Особенный интерес представляет изучение наиболее ранних событий в процессах разворачивания и сворачивания этого белка и исследование зависимости скоростей различных стадий от конечной концентрации денатуранта. Скорости стадий, отражающих разрушение или формирование больших структурных элементов, стабилизированных водородными связями и ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, обычно зависят от конечной концентрации денатуранта. Однако обнаружение при разворачивании и сворачивании карбоангидразы B быстрых начальных стадий, скорости которых не зависят от конечной концентрации денатуранта, позволяет предполагать, что соответствующие им процессы (предположительно, начало разрушения или формирования гидрофобного ядра белка) связаны не с разрушением или формированием заметного количества дополнительных внутримолекулярных взаимодействий, а с перераспределением этих взаимодействий в белке. (Институт белка РАН, лаборатория физики белка, группа д.ф.-м.н., в.н.с. Г. В. Семисотнова, тел. (0967) 73-07-68).

 

2. Исследование конформации и стабильности молекулярного шаперона GroEL в комплексе с ненативным белком показало, что взаимодействие с ненативным белком приводит к стабилизации  структуры GroEL по отношению к действию температуры, мочевины и трипсина, но не вызывает крупномасштабных конформационных изменений GroEL.

Аннотация. GroEL является молекулярным шапероном и обеспечивает правильное сворачивание других белков как in vivo, так и in vitro. Одной из основных функций GroEL является связывание ненативных конформаций полипептидных цепей. Загадкой является то, что симметричная молекула GroEL, состоящая из двух «колец», образованных семью субъединицами каждое, связывает только одну молекулу ненативного белка (т.е. что только одно кольцо из двух связывается с белковой мишенью). Предполагается, что связывание ненативного белка одним кольцом приводит к аллостерическим конформационным изменениям в другом кольце, которые ингибируют связывание второй мишени. Для проверки этого предположения мы исследовали стабильность и конформацию GroEL в комплексе с ненативными формами трех белков (лизоцима, лактальбумина и пепсина). Эти белки в присутствии дитиотрейтола становятся ненативными в результате разрыва внутримолекулярных дисульфидных связей, стабилизирующих их структуру, и образуют долгоживущий комплекс с GroEL. Исследование комплекса GroEL с ненативными белками методами сканирующей микрокалориметрии, ограниченного протеолиза и электрофореза в поперечном градиенте мочевины показали, что взаимодействие GroEL с ненативной мишенью заметно стабилизирует его структуру. Вместе с тем, конформационные изменения, приводящие к увеличению стабильности GroEL при взаимодействии с ненативным белком, не проявляются в кривых малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, что свидетельствует о незначительном масштабе этих изменений. (Институт белка РАН, лаборатория физики белка, группа д.ф.-м.н., в.н.с. Г. В. Семисотнова, тел. (0967) 73-07-68).

 

3. В продолжение исследования роли консервативных нефункциональных остатков в сворачивании белка поставлен контрольный опыт, показавший, что не-консервативный (но входящий в гидрофобное ядро) остаток 17 апомиоглобина не входит в ядро сворачивания этого белка, в то время как изученные ранее  консервативные нефункциональные остатки 14 и 131 входят в ядро сворачивания апомиоглобина.

Изучение равновесного и кинетического разворачивания контрольного мутанта апомиоглобина с заменой нефункционального и неконсервативного (но входящего в гидрофобное ядро белка) Val17 на Ala обнаружило, что эта замена сильно влияет на стабильность структуры белка, однако практически не сказывается на скорости его сворачивания. Этот результат контрастирует с данными по стабильности и кинетике сворачивания апомиоглобина с заменами консервативных Trp14 и Met131 (свидетельствующими об их сильном влиянии не только на стабильность, но также и на скорость сворачивания), т.е. изученные консервативные остатки 14 и 131 входят в ядро сворачивания белка, а неконсервативный (но входящий в гидрофобное ядро белка) остаток 17 - нет. (Институт белка РАН, лаборатория физики белка, группа д.ф.-м.н., с.н.с. В.Е.Бычковой, тел. (0967) 73-09-88).

 

4. Изучено равновесное разворачивание мутантов апомиоглобина с заменами Val 10 на Phe, Met и Ala . Показано, что при понижении рН все эти мутанты разворачиваются, как и белок дикого типа, через состояние расплавленной глобулы. Замены сильно снижают стабильность нативного состояния при  денатурации понижением рН и мочевиной, но все они (кроме замены Val10 на Ala) стабилизируют промежуточное состояние при рН-зависимой денатурации.

Аннотация: Продолжено исследование апомиоглобинов с заменами консервативных нефункциональных остатков для выяснения их роли в сворачивании  белка. Для определения стабильности белков изучено их разворачивание понижением рН и мочевиной, используя методы кругового дихроизма и триптофановой флуоресценции. Разворачивание мутантов с заменой Val10 на Phe, Met и Ala понижением рН показало, что для всех белков наблюдается состояние расплавленной глобулы. Введенные замены сильно дестабилизируют нативное состояние, т.е. переход в промежуточное состояние происходит при более высоких рН. Промежуточное состояние для этих белков наблюдается в более широкой области рН, т.е. оно более стабильно, чем у белка дикого типа (за исключением мутанта Val10Ala, промежуточное состояние которого по стабильности сходно с таковым у белка дикого типа). Разворачивание этих же белков мочевиной показало значительную дестабилизацию их нативной структуры по сравнению с белком дикого типа. (Институт белка РАН, лаборатория физики белка, группа д.ф.-м.н., с.н.с. В.Е.Бычковой, тел. (0967) 73-09-88).

 

5. Исследование конформационного поведения апо- и холо-миоглобинов в присутствии отрицательно заряженных везикул показало, что оба белка претерпевают денатурацию в зависимости от соотношения фосфолипиды:белок. При этом белки переходят в промежуточное состояние, сходное с состоянием расплавленной глобулы для этих белков в водном растворе, и в этом состоянии белки связываются с везикулами.

Аннотация: Для проверки гипотезы о том, что белки в клетке, при непосредственном контакте с отрицательно заряженной мембранной поверхностью, могут приобретать более гибкую структуру, сходную по свойствам с состоянием расплавленной глобулы, было изучено влияние отрицательно заряженных везикул, состоящих из фосфатидилглицерина (POPG), на структуру двух нейтральных белков – апо- и холо-миоглобинов. Методами кругового дихроизма в дальней и ближней УФ областях, триптофановой флуоресценции, дифференциальной сканирующей микрокалориметрии, поглощения в полосе гема и разделительной хроматографии (FPLC) показано, что оба белка претерпевают переход в промежуточное состояние, которое сходно с состоянием расплавленной глобулы, так как характеризуется разрушением жесткой третичной структуры, сохранением вторичной структуры и достаточно гидрофобным окружением триптофана. В этом промежуточном состоянии миоглобины связываются с везикулами, как это следует из гель-хроматографии. Полное связывание наблюдается для апо формы при соотношении липид:белок равным 50:1, а для холо белка – при 200:1, т.е. при более высокой концентрации отрицательно заряженных фосфолипидов (так как структура холо формы более стабильна, чем апо формы). Эта работа является частью систематического исследования конформационного поведения  белков с различным суммарным зарядом в присутствии везикул, охватывающем положительно заряженный цитохром с, отрицательно заряженный цитохром b5, почти нейтральный ретинол-связывающий белок и нейтральные миоглобины. (Институт белка РАН, лаборатория физики белка, группа д.ф.-м.н., с.н.с. В.Е.Бычковой, тел. (0967) 73-09-88).

 

6. Показано, что, в то время как скорости сворачивания небольших белков определяются в основном топологией их нативной структуры и не зависят от размера белка, скорости сворачивания прочих белков (как крупных белков, так и маленьких пептидов) определяются в основном их размером и не зависят от топологии их нативной структуры.

Аннотация: Со времени работы Plaxco et al. (1998) было хорошо известно, что скорости сворачивания небольших белков (сворачивающихся в одну стадию по принципу «все-или-ничего») определяются в основном топологией их нативной структуры, точнее –  «контактным порядком», т.е. средним расстоянием по цепи между контактирующими остатками, деленным на длину цепи белка. Было известно также, что «контактный порядок» не коррелирует со скоростью сворачивания для всех других белков. Мы показали,  что скорости сворачивания как крупных белков, при сворачивании которых наблюдаются интермедиаты, так и маленьких пептидов определяются в основном длиной их цепи, в то время как скорости сворачивания небольших, сворачивающихся в одну стадию не зависят от их размера. (Институт белка РАН, зав. лабораторией физики белка д.ф.-м.н. А.В. Финкельштейн, тел. (0967) 73-09-74, и к.ф.-м.н., с.н.с. О.В. Галзитская, тел. (0967) 73-89-75).

 

7. В ходе широкомасштабного опыта по предсказанию белковых структур «вслепую» (CASP) показано, что одновременное протягивание множества белковых последовательностей, гомологичных той, пространственную структуру которой надо предсказать, по скелетам всего множества гомологичных (в рамках каждого семейства) белков, позволяет существенно уточнить опознавание трехмерных укладок белков по их аминокислотным последовательностям.

Аннотация: Для проверки достигнутого разными группами качества предсказания структур белков по их аминокислотным последовательностям периодически проводятся международные соревнования (“CASP” – Critical Assessment of  Structure Predictions), последнее из которых, с участием более чем 200 групп из разных стран, прошло в мае-декабре сего года. Результаты нашей группы оказались в числе 10-15% лучших, в основном – за счет того, что мы использовали одновременное протягивание множества белковых последовательностей, гомологичных той, пространственную структуру которой надо было предсказать, по скелетам всего множества гомологичных (в рамках каждого семейства) белков. Этот подход был обоснован в наших работах 1998-2000 гг. и теперь широко применяемся всеми ведущими группами. (Институт белка РАН, зав. лабораторией физики белка д.ф.-м.н. А.В. Финкельштейн, тел. (0967) 73-09-74).

 

8. Выделена первая стандартная супервторичная структура, «две сцепленных пары b-участков», состоящая из двух кусков белковой цепи (а не из единого куска, как то характерно для всех описанных до сих пор супервторичных структур.

Аннотация: В пространственных структурах белков типа «b-сэндвич» (охватывающей 69 суперсемейств в 38 негомологичных мотивах укладки белковых цепей) выделена новая супервторичная структура, «две сцепленных пары b-участков», наблюдаемая в 94% всех  b-сэндвичей.  В отличие от ранее описанных супервторичных структур, «две сцепленных пары b-участков» не является локальной: она состоит не из не из единого куска белковой цепи, а из двух.  Оказалось, что эта структура даже более характерна для внутренней части b-сэндвичей, как чем хорошо известный «греческий ключ» - для краев b-сэндвичей. В сцепленных парах b-участков выделены 12 ключевых, пространственно-инвариантных позиций, восемь из которых заняты почти исключительно гидрофобными группами, в основном (в 80% случаев) – валином, изолейцином, лейцином и фенилаланином. Эта работа отмечена специальным призом конференции “Critical Assessment of  Structure Predictions”. (Институт белка РАН, зав. лабораторией физики белка д.ф.-м.н. А.В. Финкельштейн, тел. (0967) 73-09-74, совместно с И,М,Гелфандом и А.Е.Кистером, Математический факультет университета Ратгерс, США; тел. 1-732-445-3489).

 

 

     



To main page