Сейчас известно уже порядка сотни тысяч белковых последовательностей. Но "всего" для нескольких тысяч из них, т.е. всего для нескольких процентов определены, рентгеном или ЯМР, их пространственные структуры. При этом многие из недавно определенных последовательностей просто считаны с ДНК или РНК, т.е. никто не определил на опыте, чем занимаются сделанные из них белки.
       Что же можно сказать о трехмерных структурах тех последовательностей (я их буду называть "новыми"), для которых эксперимент  —  рентген или ЯМР  —  еще не сказал своего слова?

       Прежде всего возникает мысль о предсказании трехмерной структуры "новой" последовательности на основании родственного сходства  —  или, как говорят, "гомологии" ее первичной структуры с какими-то из "старых" последовательностей, пространственное строение коих уже расшифровано. Опыт показывает, что даже не очень сильного сходства последовательностей достаточно для очень хорошего сходства пространственных структур: как говорят, пространственная структура более консервативна, чем аминокислотная последовательность.
       Установление гомологии первичных структур  —  действительно, очень мощный метод выяснения родства структур (причем не только белков, а и фрагментов ДНК и РНК  —  но я буду говорить о белках).
       Однако надежно он работает, надежно устанавливает сходство первичных пространственных структур только на достаточно близких последовательностях. Этот случай иллюстрируется Рис.19-1.
 
 
 

       Рис.19-1. Гомологичные аминокислотные последовательности N-концевых фрагментов цитохромов c различных митохондрий и хлоропластов эукариотов. Жирным шрифтом выделены остатки, идентичные оным в человечьем (human) белке, подчеркнуты  —  сходные с ними. Выравнивание аминокислотных последовательностей взято из [6].
 
 

       Хуже обстоит дело, когда белки в семействе сильно варьируют (Рис.19-2).
       В этом случае на помощь приходит компьютер. Разработано множество программ, ищущих гомологии; с ними можно работать по Интернет. Назову только самые популярные из этих программ: BLAST и PSI-BLAST. Все они строят выравнивание (alignment) последовательностей, добиваясь наибольшего сходства между ними. При этом за повышение сходства часто приходится платить "разрывом" последовательностей (см. знаки "-" на Рис.19-2).
 
 
 

       Рис.19-2. Аминокислотные последовательности N-концевых фрагментов рибонуклеаз Н бактерии (E.coli), эукариота (дрожжи, yeast), и трех разных вирусов. Множественное выравнивание делалось так, чтобы не допустить разрывов последовательностей (см. "- - -") внутри a- и b-структурных участков. Жирным шрифтом выделены остатки, идентичные в трех и более из этих пяти последовательностей. Черными точками отмечены остатки активного центра, пустыми кружками и ромбами  —  остатки, вовлеченные в два гидрофобных ядра этого белка. Внизу отмечены остатки, совпадающие ( = ) и сходные ( : ) у последовательностей из RSV и HIV (помещенных в двух нижних строках выравнивания), а также указана вторичная структура рассматриваемых белков. Картинка, с небольшими изменениями, взята из [7].
 
 

       Разные программы по-разному оценивают, чего стоит совпадение остатков, чего  —  сходство, чего  —  несовпадение, чего  —  начало разрыва, чего  —  каждый дополнительный остаток в разрыве. Все эти оценки оптимизируются авторами так, чтобы удовлетворительно выделять белки, сходство которых уже известно из других данных, и потом "зашиваются" в программу. Пользуясь программой, люди ("пользователи") обычно даже не знают, что "хорошо" согласно этой программе, что "плохо", а просто говорят: "установлено, что гомология последовательностей составляет 25%"  —  имея в виду, что 25% выровненных остатков совпали друг с другом.
       Встает вопрос  —  свидетельствуют ли эти 25% о сходстве последовательностей? Для ответа на этот вопрос необходимо сравнить, пользуясь той же программой, заведомо несходные последовательности. И тут выясняется, что "гомология" несходных белков (Рис.19-3) обычно составляет 10-15%, иногда  —  20%, и порой  —  даже 25%!
 
 
 

       Рис.19-3. Выравнивание аминокислотных последовательностей непохожих, негомологичных белков [в данном случае  —  a-спирального РНК-связывающего белка (rop) и b-структурного белка холодового шока (mjc)] часто дает 10-15% совпадающих аминокислотных остатков [в данном примере  —  10 остатков (см. жирный шрифт) из 69, т.е. 14.5%]. Выравнивание сделано программой BLAST.
 
 

       Эти цифры меняются от программы к программе. Однако накопленный опыт показывает, что тогда, когда "хорошая" (по общему мнению) программа дает совпадение свыше 30-35% остатков,  —  то выявленной гомологии можно смело доверять (с оговоркой: при длине сравниваемых последовательностей свыше 50, а лучше  —  100 остатков). Правда, надо учитывать что 30 — 35% гомологии между последовательностями, верно (как правило) свидетельствуя об их родстве, позволяют правильно наложить друг на друга только 70-80% их пространственных структур, давая неверное предсказание о сходстве остальных 20-30%. А для того, чтобы верно проследить структуру 95% главной цепи "нового" белка, нужно, чтобы его гомология с белком с известной структурой достигала 40 — 50%.
       Если же сходство пары последовательностей не превышает 10-15%  —  то их родство обычно нельзя обнаружить: такое сходство находится на уровне шума (что, однако, не является доказательством, что белки не похожи, не гомологичны  —  я к этому еще вернусь). А от 15 до 25 и даже до 30% простирается "сумеречная зона": кажется, что белки гомологичны,  —  но кто поручится?...
       К сожалению, все эти цифры не вполне одинаковы у разных программ (и у разных режимов их работы), а к программе они, эти цифры, обычно не прилагаются (они есть в исходных статьях, но кто их читает...),  —  так что я бы рекомендовал, прежде чем доверяться любой такой программе, проверить ее (именно ее, и именно в используемом Вами режиме) на известных вам белках примерно той же длины (и сходных, и несходных) и понять, "что такое хорошо и что такое плохо" (другой вариант: прочесть исходную статью...).
       Больше всего все эти оценки достоверности и недостоверности найденного сходства "плавают" от программы к программе из-за того, что разные авторы по-разному оценивают "штраф" за разрыв последовательности. Если его положить нулевым, то есть позволить делать любые разрывы "бесплатно",  —  случайно выбранные белковые (и вообще 20-буквенные) последовательности дают сходство на уровне 30-35% (а ДНКовые, 4-буквенные  —  на уровне 65%)!
       Опыт показывает, что оптимальное отделение "похожих" от "непохожих" белковых последовательностей достигается, когда начало разрыва последовательности штрафуется в цену двух или трех дополнительных совпадений аминокислотных остатков, а за удлинение разрыва платится примерно 1/20  —  1/100 этой цены за каждый дополнительный остаток в разрыве.
       Я умышленно не говорю ничего о математике, лежащей в основе алгоритмов поиска гомологий. Это нас увело бы слишком далеко. Хочу, однако, произнести ключевые слова: "динамическое программирование". Это  —  название самого мощного метода, применяемого для оптимизации одномерных систем (а последовательность  —  система именно одномерная),  —  в частности, для оптимизации выравнивания одной последовательности относительно другой.

       Можно ли распознать гомологичность, родственность последовательностей, если их сходство лежит ниже уровня в 30%,  —  т.е. в "сумеречной зоне" или даже ниже ее? Можно  —  но для этого надо сравнивать интересующую нас последовательность со многими последовательностями семейства, и обращать внимание преимущественно на те позиции в цепи, что доказали свою консервативность именно в этом семействе.
       Рисунок 19-2 показывает, что рибонуклеаза Н вируса иммунодефицита человека (HIV) имеет не очень высокое  —  "на уровне шума"  —  сходство с другими рибонуклеазами Н, если рассматривать всю цепь (так, из 60 выровненных остатков у нее есть всего 9 общих  —  15% совпадений  —  с рибонуклеазой Н из RSV). Однако это сходство проявляется именно в тех ключевых районах, где все остальные рибонуклеазы похожи друг на друга. Это резко повышает достоверность такого сходства. А если еще учесть, что эти "ключевые районы" совпадений охватывают все аминокислотные остатки активного центра, и что сходство концентрируется в участках вторичной структуры, и что оно охватывает около 30% (а не 15%) остатков гидрофобных ядер белка,  —  высокая достоверность переходит в уверенность в правильном опознании гомологии.
       Для опознания гомологии "новых" последовательностей также удобно пользоваться "консенсусными последовательностями" (Рис.19-4), выведенными для уже изученных белковых семейств и подчеркивающими их наиболее консервативные черты. Иногда такие консенсусные последовательности (снабженные данными по частотам встречаемости остатков в каждом месте цепи) называют "профилями первичных структур".
 
 
 

       Рис.19-4. Аминокислотный состав различных позиций в N-концевых фрагментах цитохромов c митохондрий эукариот. Самые важные, консервативные остатки цепи определены однозначно. Подчеркнута последовательность "сайта" Cys-X-X-Cys-His, отвечающего за связывание гема в подавляющем большинстве цитохромов (и не только c, и не только эукариот). Выравнивание аминокислотных последовательностей взято из [6].
 
 

       При опознавании функционального сходства белков следует также обращать внимание на уже установленные для многих функций "сайты"  —  более или менее короткие последовательности, обеспечивающие эти функции (см. на Рис.19-4 сайт Cys-X-X-Cys-His, связывающий гем в цитохромах). Такие сайты собраны в библиотеки, и их поиском занимаются специальные программы, из которых PROSITE является наиболее популярной.

       При установлении структуры "нового" белка по его гомологии с уже изученным надо ясно отдавать себе отчет, что сходство пространственных структур может не распространяться на районы, где последовательности сильно разошлись. В основном это (см. Рис.19-2) районы петель, нерегулярных конформаций белковой цепи. Здесь, с весьма переменным пока успехом, приходится прибегать к конформационным расчетам и другим методам гомологического моделирования, на которых я останавливаться не буду.

       Перейдем к методам предсказания пространственной структуры "новых" последовательностей, не имеющих видимой гомологии с уже расшифрованными белками.
       К ним относится около 2/3 "новых" последовательностей. Поэтому о пространственной укладке большинства последовательностей, получаемых в ходе выполнения генетических проектов, мы не можем догадаться по их гомологии с белками уже известными  —  она или слишком слаба для обнаружения, или отсутствует. Тут-то и возникает настоятельная потребность в решении задачи предсказания пространственной структуры  —  а, в перспективе, и функции белка,  —  по его аминокислотной последовательности (Рис.19-5).
 
        Рис.19-5. Схема первичной и пространственной структуры маленького белка (панкреатического ингибитора трипсина). Ход главной цепи изображен на фоне общего контура молекулы; выделены a-спирали, b-тяжи, резкий поворот цепи (t) и цистеиновые мостики ( - - - ). Так как белок сворачивается сам собой, то  —  в принципе  —  все это можно предсказать по одной лишь первичной структуре белка. Боковые группы здесь не показаны, но  —  в принципе  —  и их расположение в пространстве тоже можно предсказывать.
 
 

       Надо сразу сказать, что абсолютно надежных и точных методов предсказания белковых структур сейчас нет.
       Причин тому, видимо, две: (а) ограниченная точность энергетических оценок, на которых базируется теоретический расчет белковых структур, и (б) сравнительно малая разность между "правильно" и "неверно" уложенными белковыми цепями. Я хочу особо подчеркнуть последнее обстоятельство,  —  оно резко отличает ситуацию в белках (и РНК) от ситуации в ДНК,  —  к большому огорчению людей, занявшихся предсказаниями структур белков по их аминокислотным последовательностям. В ДНК комплементарное спаривание нуклеотидов наблюдается по всей длине двойной спирали, а оно обеспечивается тем, что одна цепь по своей первичной структуре строго комплементарна другой. Это и дает огромный свободно-энергетический выигрыш "правильной" структуры ДНК над всеми "неправильными". А в белках (и РНК) ни какой-либо строгой комплементарности, ни следующего из нее огромного энергетического преимущества "правильной" укладки цепи не наблюдается...
       Однако существующие методы дают все более полную и надежную информацию о возможном строении (или, чаще, о возможных вариантах строения) белка или, особенно, его структурных элементов.
       В прагматическом аспекте, вопрос о предсказании трехмерного строения белка сейчас ставится следующим образом: похожа ли пространственная структура рассматриваемой белковой последовательности на какую-либо из уже известных пространственных белковых структур? Если да, то как рассматриваемая последовательность вписывается в эту структуру? Если нет, можем ли мы указать какие-либо характерные детали пространственной организации рассматриваемой последовательности?

       Я знаю несколько случаев, когда ответы на эти вопросы существенно способствовали экспериментальному определению структуры и/или функции изучаемой аминокислотной последовательности, помогли планировать белково-инженерные эксперименты и так далее. Впрочем, должен сказать, что я бы с большим интересом прочел бы хороший обзор о практическом применении предсказаний белковых структур...

       Перейдем теперь к методам предсказания белковых структур. Рассматривая эти методы, я буду уделять особое внимание тем идеям, и в основном физическим идеям, что лежат в их основе.

       Есть две стратегии предсказания белковых структур. Согласно первой стратегии, белковая структура ищется как результат кинетического процесса сворачивания.
       Согласно второй,  —  она ищется как структура с минимально возможной для данной цепи свободной энергией.
       В принципе, по-видимому, обе эти стратегии могут привести к правильному результату, так как самая стабильная структура белковой цепи, несмотря на опасения Левинталя, образуется достаточно быстро (этому вопросу была посвящена отдельная лекция, и сейчас я позволю себе его не касаться).
       Важно, однако, что, рассматривая предсказание белковых структур, мы можем отвлечься от путей сворачивания и рассматривать только результат  —  стабильную структуру белка. Тем более, что первая стратегия  —  стратегия имитационного моделирования процесса сворачивания белка  —  пока существенного прогресса не дала: уж очень сложны все расчеты, и к тому же   —  все же весьма приблизительны все потенциалы взаимодействий. Вторая стратегия оказалась более успешной.

       Начнем с определения стабильной вторичной структуры белка по его аминокислотной последовательности. a-спирали и вытянутые b-участки  —  важнейшие элементы белковых глобул, во многом определяющие, как вы помните, их общую архитектуру (Рис.19-5).
       Забудем пока о том, что белковая цепь свернута в глобулу, т.е. рассмотрим развернутую белковую цепь. Можем ли мы предсказать ее вторичную структуру по аминокислотной последовательности? Оказывается  —  да, в основном да, пусть и не абсолютно точно.

       Прежде всего,  —  какие аминокислотные остатки будут стабилизировать вторичную структуру  —  например, a-спираль,  —  а какие будут разрушать ее?
       Эксперименты дают прямой ответ на этот вопрос. Я имею в виду огромную работу по оценке a- и b-образующих способностей аминокислотных остатков, проведенную в группах Шераги, Фасмана, Болдвина, Фершта, Серрано, ДеГрадо, Кима и в ряде других групп (и, в частности, у нас  —  В.Е.Бычковой и О.Б.Птицыным). Кроме того, богатый (и хорошо совпадающий с физико-химическим экспериментом) материал дает статистика аминокислотных последовательностей a- и b-структур в белках. Рисунок 19-6 суммирует важнейшие (те, которые стоит запомнить) из оценок, полученных всеми этими методами.
 
 
 

       Здесь надо, однако, сразу сказать, что все закономерности, наблюдающиеся в структурах белков, носят вероятностный, частотный характер. Несмотря на многочисленные попытки, не удалось выделить никакого четкого "кода" белковых структур  —  то есть ничего похожего на то четкое A-T и G-C спаривание нуклеотидов, которое свойственно двойной спирали ДНК. Впрочем, надо признать, что уже в РНК  —  с их разнообразным, в отличие от ДНК, репертуаром пространственных структур  —  спаривание нуклеотидов происходит далеко не столь однозначно...

       Подавляющее большинство из полученных экспериментальных и статистических оценок можно легко понять, исходя из физики и стереохимии аминокислот. Мы уже говорили об этом на одной из прошлых лекций.
       Так, Pro не любит входить ни в a-спираль (кроме ее N-концевого витка), ни в b-структуру. Почему? Потому, что у него нет NH-группы, и он не может завязывать соответствующие a- и b-структуре водородные связи; а на N-конце спирали NH-группа таких связей и не должна завязывать,  —  и Pro там встречается часто, тем более что его угол y уже фиксирован пролиновым кольцом в подходящем положении. По тем же причинам часто встречается Pro и на N-конце изгибов.
       А вот Ala стабилизирует a-спираль,  —  а Gly разрушает и ее, и b-структуру, и способствует образованию клубка. С чем связана эта разница? С тем, что область конформаций, т.е. область допустимых углов f,y для Gly в клубке гораздо больше, чем для Ala,  —  в то время как допустимые конформации для обоих этих остатков в a-спирали примерно совпадают.
       По аналогичным причинам разветвленные остатки  —  Val, Ile и Thr  —  больше стабилизируют b-структуру, где их боковые группы имеют 3 разрешенных поворотных изомера, чем a-спираль или клубок, где они имеют только 1 изомер (при каждом значении f и y).
       Вообще же гидрофобные группы склонны несколько чаше входить в a- и b-структуру, где они могут слипаться в гидрофобных кластерах (см. Рис.19-6), чем в клубок, где они этого делать не могут. А вот боковые группы с диполями, особенно  —  в короткой боковой цепи, больше склонны входить в нерегулярные участки цепи, где они могут завязывать дополнительные нерегулярные водородные связи, чем в a- и b-структуры, где доноры и акцепторы водородных связей уже насыщены внутрицепными связями.

       Более того, влияние аминокислотных остатков на вторичную структуру можно оценить теоретически. Так, еще до получения экспериментальных оценок, в начале и середине 70-х годов, мы с О.Б.Птицыным предсказали, что отрицательно заряженные остатки должны стабилизировать N-конец спирали, притягиваясь к его положительному парциальному заряду, и дестабилизировать ее С-конец, отталкиваясь от отрицательного парциального заряда спирального диполя. Положительно же заряженные остатки должны действовать в прямо противоположном направлении. При этом потенциал каждого такого взаимодействия должен, по теоретической оценке, составлять 1/4 или 1/3 килокалории. Что и было подтверждено экспериментально.

       Зная, какие аминокислотные остатки стабилизируют середину спирали, какие  —  ее N-конец, а какие  —  C-конец, мы получаем нечто вроде "шаблона" спирали. Шаблон a-спирали можно описать так: если начало фрагмента белковой цепи обогащено отрицательно заряженными группами, да еще там стоит Pro; если середина этого фрагмента обогащена остатками Ala, Leu и Met, а Pro и Gly там нет; и если его С-конец содержит положительно заряженные боковые группы,  —  то перед нами a-спиральный участок. Кроме того, для стабильности a-спирали полезен, а для ее включения в глобулу  —  просто необходим определенный (Рис.19-6) порядок чередования гидрофобных групп в цепи: этот порядок способствует слипанию этих групп и, кроме того, приводит к образованию на спирали сплошной гидрофобной поверхности, необходимой для ее прилипания к глобуле.
       То есть "шаблон" качественно описывает аминокислотную последовательность, подходящую для образования a-спирали. Чем лучше аминокислотная последовательность удовлетворяет этому шаблону  —  тем вероятнее спираль в данном месте цепи. Такое же описание  —  "шаблон"  —  можно составить и для участков, пригодных для образования b-структуры. А также  —  для участков, особо пригодных для образования b-изгибов и петель.

       Более того, "шаблоны" можно применять и для описания кусков цепи, образующих более сложные структуры,  —  например, для описания b-a-b суперспиралей, состоящих из двух параллельных b-участков и a-спирали между ними (Рис.19-7). Такие структуры типичны для доменов, связывающих нуклеотиды. Особо важную роль в "шаблоне" играют так называемые "ключевые позиции", которые могут быть заняты только строго определенными аминокислотными остатками,  —  например, Gly: только этот остаток может находиться в конформации с f>60^о, недоступной всем остальным остаткам.
 
 
 

       Рис.19-7. "Шаблон" суперспирали b-a-b, связывающей нуклеотиды. Квадратики отмечают ключевые позиции, обычно занимаемые сравнительно небольшими гидрофобными остатками (Ala, Ile, Leu, Val, Met, Cys): это  —  гидрофобное ядро суперспирали b-a-b. Черные кружки  —  позиции, занимаемые только Gly: здесь находятся резкие повороты цепи. Пустой треугольник отмечает первую позицию мотива b-a-b, где обычно находится положительно заряженная или дипольная боковая цепь. В последней (-) позиции мотива b-a-b находится аминокислота Asp или Glu, связывающая лиганд (нуклеотид). Рисунок, с небольшими изменениями, взят из R.K.Wierenga et al., J. Mol. Biol. (1986) 187:101-107.
 
 

       Но вернемся к расчету вторичной структуры. Зная вклады отдельных взаимодействий в стабильность a-спирали, мы можем рассчитать свободную энергию спирализации любого участка цепи, а следовательно  —  и Больцмановскую вероятность образования спирали в любом месте полипептидной цепи, еще не свернувшейся в глобулу. Суммируя и усредняя эти вероятности, мы можем рассчитать и среднюю спиральность такого "несвернутого" полипептида. Вот уже более 15 лет мы используем для этого нашу программу ALB. В одном из режимов ("unfolded chain"  —  "развернутая цепь") она позволяет рассчитывать содержания a- и b-структуры в полипептидах и в несвернутых белковых цепях,  —  причем при разной температуре, ионной силе и рН раствора. Потом результат можно сравнить с опытными данными  —  например, с КД спектрами. Рисунок 19-8 показывает, что теоретический расчет неплохо совпадает с опытом.
 
 
 

Рис.19-8. Теоретическая (вычисленная программой ALB  —  unfolded chain) и экспериментально найденная спиральность нескольких десятков пептидов при температуре 0о-5оС и разной ионной силе и рН раствора. Рисунок взят из A.V.Finkelstein, A.Y.Badretdinov & O.B.Ptitsyn, Proteins (1990) 10:287-299.

 

       Переходя к расчету и предсказанию вторичной структуры белков, глобулярных белков, необходимо учесть, что здесь к взаимодействиям, существующим в несвернутых цепях, добавляется взаимодействие каждого участка цепи с глобулой, строения которой мы не знаем. Точнее, мы не знаем ее детального строения, но знаем, что участки цепи как-то примыкают к гидрофобному ядру белка. В простейшем приближении взаимодействие с ядром можно аппроксимировать взаимодействием с "гидрофобным озером", на котором плавает белковая цепь (Рис.19-9).
 
 
 

       Рис.19-9. Флуктуирующая вторичная структура белковой цепи (здесь: b  —  b-тяж, l  —  петля, a  —  a-спираль) на поверхности гидрофобного озера, имитирующего белковую глобулу ("модель плавающих бревен"). Модель учитывает разное чередование обращенных к поверхности озера (), от поверхности () и вдоль нее (®, ¬) боковых групп в разных вторичных структурах, а также эффекты на N- и С-концах спирали, объединенные и приписанные ее, соответственно, N- и С-концевым остаткам (a^N ,a^C). Рисунок, с небольшими изменениями, взят из O.B.Ptitsyn & A.V.Finkelstein, Bipolymers (1983) 22:15-25.
 
 

       Зная из опыта силу гидрофобных взаимодействий, а из стереохимии a- и b-структуры  —  мотивы чередования в цепи боковых групп, глядящих в одну и ту же сторону и способных, следовательно, одновременно взаимодействовать с гидрофобной поверхностью,  —  мы можем сосчитать вероятность образования a-спирали и b-структуры в каждом месте белковой цепи. Этим также  —  но уже в режиме "глобулярная цепь" ("globular chain")  —  также занимается программа ALB (кстати, к ней можно обращаться по Интернет: http://indy.ipr.serpukhov.su/~rykunov/alb/).

       Вероятности рассчитываются при комнатной температуре. Почему при комнатной? Не лучше ли выделять только самое лучшее по энергии расположение a- и b-структур в цепи, т.е. рассчитывать все вероятности при 0^оК?
       Прежде всего, конечно, расчет относится к комнатной температуре потому, что все экспериментальные оценки стабильности, на которых базируется расчет, относятся к этой температуре.
       Но еще важнее то, что вероятности, рассчитанные именно при такой температуре (300^оК), лежащей чуть ниже нормальной температуры плавления белка (350^оК) наилучшим образом позволяют отделить более вероятные a- и b-участки, в которых мы можем быть более или менее уверены, от тех "менее вероятных", в которых мы уверенными быть не можем.
       Ведь, в сущности, мы стараемся предсказать вторичную структуру белка только по части тех взаимодействий, что ее держат в действительности: мы знаем (и то приблизительно) внутренние взаимодействия в этой структуре, но не знаем (или можем лишь крайне грубо оценить) те, что действуют между рассматриваемым куском цепи и остальной глобулой. А они очень мощны.
       То есть мы находимся в том же положении, как если бы пытались предсказать, будет ли данный остаток внутри белка или на его поверхности, зная только его собственную гидрофобность  —  и больше ничего. И мы знаем, что такая задача имеет ответ,  —  но ответ не точный, а вероятностный. Этот ответ содержится в наблюдаемой статистике распределения остатков между нутром и поверхностью глобулы. Мы уже знаем, что она выглядит так:
 

ВЕРОЯТНОСТЬ_ВНУТРИ / ВЕРОЯТНОСТЬ_НА_ПОВЕРХНОСТИ ~  ~ exp(—ГИДРОФОБНАЯ_СВОБОДНАЯ_ЭНЕРГИЯ/kTC),

(19.1)

где T_С  —  характерная температура белковой статистики, лежащая  —  как мы тоже помним  —  несколько ниже температуры плавления белка.
       И  —  возвращаясь к предсказаниям белковых структур  —  по той же формуле (19.1), и с той же температурой Т_С мы можем вероятностно предсказывать существование рассматриваемой вторичной структуры, зная только ее собственную свободную энергию.

       Рисунок 19-10 иллюстрирует расчет вторичной структуры в глобуле. Он был сделан в 1985 г. для интерферонов. Видно, что в них преобладают a-спирали, особенно в N-концевой части цепи, где (как было известно из других опытов) находится функциональный домен интерферона. В данном случае спирали эти предсказывались столь уверенно (а это бывает отнюдь не всегда) и столь одинаково в разных, не так уж и высоко гомологичных цепях, что мы попробовали  —  в том же 1985 г.  —  слепить домен из этих спиралей.
 
 

Рис.19-10. Расчет вторичной структуры нескольких интерферонов. Абсцисса  —  номер остатка в белковой цепи, ордината  —  вычисленная вероятность его a-спирального ( ____ ) и b-структурного ( _ _ _ ) состояния. Сверху приведены предсказания наиболее вероятных a-спиралей (a), b-тяжей (b) и изгибов (Т). Черные прямоугольники  —  уверенное предсказание вторичной структуры, пустые  —  не столь уверенное предсказание, линии  —  данная вторичная структура в принципе не исключена, но маловероятна. Цепь, образующая N-концевой домен, подчеркнута внизу рисунка. Картинка взята из O.B.Ptitsyn, A.V.Finkelstein & A.G.Murzin, FEBS Letters (1985) 186:143-148.

 

       Полученный комплекс, пучок из трех больших спиралей и одной крошечной, показан на следующем рисунке (19-11а). Через пять лет после того, как было сделано это предсказание, была, наконец, получена рентгеновская структура интерферона b (Рис.19-11б),  —  и рентгеновская структура N-концевого его домена довольно точно совпала с той, что была предсказана нами.



                    а                                    б                                    в

       Структура N-концевого домена интерферона  —  одна из первых, более или менее успешно предсказанных до опыта структур белковых молекул.

       Хочу подчеркнуть факторы, способствовавшие успеху предсказания: a-спирали предсказаны здесь очень уверенно; и они одинаково расположены в отдаленно-гомологичных цепях, что позволяет им доверять.
       Однако столь уверенное и повторяющееся в гомологах предсказание вторичной структуры встречается на практике не часто. Более типичны некоторые разночтения, как в С-концевом домене интерферонов (Рис.19-10), для которого  —  именно вследствие этого, очень типичного небольшого разночтения  —  однозначного предсказания укладки цепи получить не удалось.
       И еще очень важная вещь для успеха предсказания строения интерферона. Когда мы искали наилучшую упаковку предсказанных a-спиралей, мы могли рационально организовать перебор всех возможных упаковок, так как располагали априорной классификацией a-спиральных комплексов (я об этом уже говорил)  —  она как раз была разработана к тому времени Мурзиным и мной.

       Вернемся к предсказанию вторичной структуры.
       Оно носит вероятностный характер: точность распознавания a-, b-структуры и нерегулярных петель белка по его аминокислотной последовательности составляет около 65%.
       Можно ли улучшить предсказание вторичной структуры? Да. В методе "PHD" Роста и Сандера (очень его рекомендую, он доступен по Интернет) вторичная структура предсказывается не для одной аминокислотной последовательности, а для набора гомологов. В результате такого подхода случайные погрешности как бы сглаживаются и предсказание становится намного более точным (достигая, в среднем, 72-73% вместо 63-65%).
       Итак  —  несмотря на свою ограниченную точность, предсказание вторичной структуры стало уже, по сути, рутинной процедурой исследования первичной структуры белка.

       Перейдем теперь к новой, быстро развивающейся области  —  к работам по предсказанию пространственных укладок белковых цепей.

       Проблему предсказания белковой структуры можно представить себе как проблему выбора той структуры, которая наиболее стабильна для данной аминокислотной последовательности. Проблема заключается в том, откуда взять "возможные белковые структуры". Самый простой, прагматичный ответ  —  взять из Банка Белковых Структур. Там, конечно, нет еще всех возможных структур  —  но есть надежда, что там есть примерно половина всех существующих в природе мотивов укладки белковых цепей в домены. Эту надежда  —  ее обосновал Сайрус Чотиа  —  основана на том, что вновь расшифровываемые белки (точнее  —  их домены) все чаще и чаще оказываются похожими на уже расшифрованные.
       Кстати, сейчас разворачивается большой проект "Structural Genomics", цель которого  —  расшифровать пространственное строение хотя бы одного представителя каждого семейства белков (а их  —  порядка 10000). Когда эта программа будет завершена  —  для этого придется потратить примерно 10 миллиардов $ за 10 лет  —  все предсказание структур "новых" белков можно будет  —  мы надеемся на это  —  делать по гомологии с уже расшифрованными белками. Однако пока что приходится использовать лишь вероятностные методы предсказания; в настоящее время они  —  точнее, лучшие из них  —  дают правильный ответ (для белков, не имеющих видимой гомологии с уже расшифрованными) примерно в 30% случаев.

       Итак, предсказывая структуру белка, не имеющего видимой гомологии с белками уже расшифрованными, можно попробовать взять, одну за другой, все пространственные структуры из Банка, наложить (возможно, с некоторыми выпетливаниями, см. Рис.19-12) цепь этого белка на каждую из них, и посмотреть, какая из этих пространственных структур даст  —  для нашей цепи  —  наибольший энергетический выигрыш. При этом мы должны разрешать цепи то идти по скелету структуры, то выпетливаться или "сокращать" имеющиеся в скелете выпетливания  —  если это увеличивает энергетический выигрыш.
 
 
 

       Рис.19-12. Схема, иллюстрирующая идею "протягивания" исследуемой последовательности по Банку Белковых Структур. Жирная линия показывает те участки, где последовательность идет по скелету, пунктир  —  те, где она выпетливается.
 
 

       Такой подход называют "методом протягивания" (threading method). Он был предложен нами с Б.А.Ревой в 1990 г. и  —  независимо, в более простом и более удобном варианте  —  Д. Айзенбергом и его группой в 1991 г. Сейчас метод протягивания стал весьма популярным методом опознавания структур "новых" белков по их аналогии со "старыми".
       В общем, работа по протягиванию напоминает поиск гомологии,  —  только на этот раз "выравниваются" не две первичные структуры, "новая" и "старая", а "новая" первичная структура со "старым" белковым скелетом.

       Прежде, чем перейти к результатам,  —  хочу подчеркнуть две принципиальные проблемы метода "протягивания". В сущности, аналогичные проблемы, в том или ином виде, возникают в любом "предсказательном" методе.
       Во первых, конформацию даже тех кусков цепи, что наложены на скелет, мы знаем с большой погрешностью: ведь мы не знаем конформации боковых групп,  —  а именно они, в основном, и взаимодействуют. Далее, мы не знаем конформации всех выпетливаний. Оценка показывает, что при протягивании мы знаем примерно половину взаимодействий в белковой цепи, а вторую  —  не знаем. Значит, опять мы вынуждены судить о структуре белка по части взаимодействий, действующих в его цепи. Значит, опять наши предсказания могут носить только вероятный характер.
       Во-вторых, как перебрать все наложения и найти лучшее  —  или лучшие  —  среди них? Ведь их, возможных наложений, страшно много... Скажу коротко: мощные математические вычислительные методы для этого уже развиты, но рассказ об этом занял бы слишком много времени. Наверно, имеет все же смысл назвать эти методы по имени  —  может быть, кому-то из вас пригодится (но большинству, конечно, нет). Итак: динамическое программирование и его вариант  —  статистическая механика одномерных систем (цепных молекул)  —  для расчета протягивания цепи через скелет; теория самосогласованного поля  —  для расчета действующего на цепь молекулярного поля в каждой точке скелета; стохастическая минимизация энергии методом Монте-Карло; а также  —  разные варианты метода ветвей и границ, и т.д.

       Для примера я покажу предсказанную методом протягивания укладку цепи в белке, терминирующем репликацию. Протягивая цепь этого "нового" белка по всем известным трехмерным белковым структурам, Зиппль и его коллеги из Зальцбурга показали, что укладка гистона Н5 наиболее "родственна" этой цепи (Рис.19-13).
 
 
 

       Рис.19-13. Гистон Н5 цыпленка (1hstA, слева) и белок, терминирующий репликацию (rtp, справа); в последнем не показана С-концевая спираль, не имеющая аналога в гистоне Н5. Предсказание сходства укладки цепи в этих двух белках сделано, методом "протягивания", в работе H.Flckner, M.Braxenthaler, P.Lackner, M.Jaritz, M.Ortner & M.J.Sippl, Proteins (1995) 23:376-386; это предсказание сделано в ходе "слепого" тестирования предсказательных методов (CASP-1994). Средне-квадратичное отклонение между 65-ю эквивалентными С^a атомами в изображенных структурах  —  2.4.
 
 
 

       Рис.19-14. Последовательность гистона Н5 (1hstA), выровненная относительно последовательности белка, терминирующего репликацию (rtp) согласно рентгеноструктурным данным ("Наблюдаемая", верхняя пара последовательностей), и она же, выровненная согласно предсказанию методом протягивания ("Предсказанная", нижняя пара). Серыми зонами показаны сдвиги, расхождения этих двух выравниваний. Они хорошо видны по разным сдвигам вторичных структур гистона Н5, приведенных в самой верхней и самой нижней строке в этих двух выравниваниях. Вторичные структуры записаны в подчеркнутых строках (обозначения: Н  —  a-спираль, Е  —  b-тяж, Т  —  изгиб цепи). Точками отмечены делеции, пропуски в первичных и вторичных структурах, внесенные при их выравнивании. Картинка взята из статьи C.M.-R.Lemer, V.J.Rooman & S.J.Wodak, Proteins (1995) 23:337-355, в которой обсуждаются итоги CASP-1994.
 
 

       Таким образом они правильно опознали мотив укладки цепи белка  —  терминатора репликации. Правда, предсказанное (при помощи теоретического протягивания) наложение цепи этого белка на структуру гистона Н5 довольно сильно отличается (Рис.19-14) от того, что получается при прямом наложении трехмерных структур этих молекул. Это еще раз показывает, что все погрешности, о которых я говорил по ходу лекций  —  погрешности в параметрах стабильности, незнание точной конформации петель и т.д.  —  не позволяют выделить одну уникальную наилучшую структуру, а позволяют в действительности только найти более или менее узкий набор лучших структур. Такой набор "лучших" пространственных структур можно выделить довольно надежно; а вот какая из них окажется, согласно расчету, "наилучшей"  —  это дело случая. Нативная структура находится где-то в наборе "лучших" структур, она приблизительно соответствует предсказанной ("наилучшей"),  —  но это все, что можно реально сказать.
       Я, конечно, привел только "хорошие" примеры  —  примеры удавшихся предсказаний. Примеров неудавшихся много больше, и это понятно  —  ведь, предсказывая, надо выбрать один, или пусть несколько вариантов из бездны оцениваемых. Так что попасть рядом с такой бесконечно малой целью даже в трети или в четверти случаев (так сейчас работают наиболее успешные группы),  —  огромный успех.
       Поэтому методы "протягивания" становятся сейчас рабочим инструментом для опознавания трехмерных структур белковых последовательностей. Чрезвычайно важно, что уже сформирован рецепт  —  делай так, так и так, и в результате ты получишь одну или несколько структур, среди которых, с довольно высокой вероятностью, будет структура, сходная с трехмерной укладкой рассматриваемой последовательности.

       Можно ли улучшить опознавание белковых структур? Да, если привлечь гомологи  —  т.е. предсказывать структуру белка уже не только по его аминокислотной последовательности, а по набору гомологичных последовательностей. Этот метод улучшил предсказания вторичных структур белков. Он широко и успешно применяется при предсказании вторичных структур РНК. При опознавании пространственных укладок белковых цепей его тоже начали применять  —  при этом отдается предпочтение той укладке, что более или менее хороша для всех гомологов. Правда, при этом мы получим не точную структуру данной цепи, а некоторую обобщенную, т.е. приближенную структуру, общую для всех гомологов.

       Суммируем. Предсказание трехмерных укладок белковых цепей, с точки зрения физики, является поиском самой стабильной укладки рассматриваемой цепи (или, в современной реализации этого подхода, в "протягивании", threading'е  —  поиском структуры, наиболее совместимой с данной цепью). Такое предсказание возможно в принципе, и порой оно приводит к вполне удовлетворительному результату. Однако оно всегда имеет сложности, связанные с недостатком точной информации о репертуаре возможных укладок белковых цепей, о многих взаимодействиях в белковой цепи, с погрешностями в энергетических параметрах, и т.д.
       В результате, однозначное и надежное предсказание укладки цепи по ее последовательности вряд ли возможно,  —  но зато можно выделить несколько наиболее вероятных мотивов укладки цепи и  —  что очень важно  —  отбраковать огромное множество других укладок. И такие предсказания могут быть уточнены с учетом дополнительной информации  —  в частности, о последовательностях цепей гомологичных белков и об их возможных укладках.

       Мой сегодняшний рассказ касался в основном белков глобулярных. А что можно сказать о фибриллярных и мембранных?
       В последовательностях фибриллярных белков  —  без всякого компьютера  —  просматриваются периодичности, характерные для их вторичных структур,  —  причем они настолько очевидны, что опознание вторичных структур этих белков обычно не составляет труда. А на этой основе удается предложить несколько возможных вариантов их упаковки в фибриллу.
       Предсказание строения мембранных белков менее развито, чем предсказание строения белков глобулярных: слишком мало структур мембранных белков мы знаем. Опознать внутримембранные части таких белков довольно легко: это  —  сплошные (точнее  —  почти сплошные) гидрофобные блоки, длина которых диктуется толщиной мембраны. Однако принципы формирования укладки этих блоков в белке еще недостаточно выяснены (хотя известно главное; напомню: у мембранных белков ядро структуры  —  не гидрофобное, как у глобулярных, а полярное; гидрофобные же группы их контактируют с жиром мембраны). Поэтому работы по предсказанию пространственного строения мембранных белков только начинаются.

       В заключительной части этой лекции я хочу кратко рассказать о белковой инженерии, точнее  —  о белковом дизайне, то есть о конструировании новых белков.

       Олигонуклеотидный синтез и техника рекомбинантных ДНК дали возможность получения генов белков, не существовавших в природе; рентген и ЯМР позволили увидеть трехмерные структуры белков; а мощные ЭВМ и компьютерная графика позволили вступить в интерактивный диалог с этими пространственными структурами,  —  менять в них что-то и оценить последствия этих изменений. Объединившись, эти методы стали, соответственно, "руками", "глазами" и "мозгом" новой области молекулярной биологии  —  белковой инженерии. Ее стратегическая задача  —  создание знаний и методов, позволяющих получать белки с наперед заданной функцией и структурой. Трудно переоценить перспективность этих исследований для конструирования новых лекарств, катализаторов, для схемотехники и т.д.
       Прицельный белково-инженерный эксперимент уже дал ответ на ряд фундаментальных вопросов. Показано, что за выбор пространственной структуры отвечают далеко не все детали плотной упаковки  —  структура белка выдерживает массу точечных мутаций; и не петли  —  если заменить или вырезать из белковой цепи участок, кодирующий петлю, то "рана" на теле глобулы обычно затягивается. О том, что целенаправленное введение точечных мутаций дает массу информации об энергетике белковой глобулы и промежуточных структур на пути ее самоорганизации, мы уже говорили; а о том, как они применяются для исследования активности белка  —  поговорим на следующей лекции.
       Освоив введение мутаций в "природные" белки, белковая инженерия обратилась к дизайну, конструированию белковых молекул.
       Задача дизайна  —  обратная по отношению к задаче предсказания структуры. Если при предсказании мы должны найти пространственную структуру, наиболее пригодную для рассматриваемой последовательности  —  то при дизайне мы должны найти, сконструировать последовательность, годную для создания желаемой пространственной структуры.
       Вообще говоря, расчет искусственных конструкций может быть проще, чем предсказание структуры "натуральных" белков (расчет прочности "искусственной" башни проще, чем "натурального" дерева: она спроектирована так, чтоб поддаваться расчету!). А конструирование новых белков опирается на теорию белковых структур; их "строительными блоками" обычно служат последовательности, кодирующие мощные, внутренне стабильные и способные к эффективному слипанию a- и b-участки.

       Белковый дизайн был поставлен на повестку дня в конце 70-х  —  начале 80-х годов, когда возникла техника создания искусственных генов и техника точного химического синтеза белковых цепей. В конце 80-х  —  начале 90-х годов при помощи прикидок, проб и ошибок были созданы простейшие белковые молекулы. Их архитектуры брались из природных белков, а их аминокислотные последовательности подбирались так, чтобы, не будучи гомологичными природным, стабилизировать эту архитектуру.

       Первым был сделан  —  в группе ДеГрадо  —  четырехспиральный пучок (Рис.19-15). Дизайн проводился в тесном диалоге с экспериментом. Исследование окончательного варианта белка показало, что он спирален и глобулярен; и структура этого искусственного белка оказалась гораздо стабильнее, устойчивее к нагреву, чем структура любого "естественного" белка! Потом, правда, оказалось, что этот белок не плавился при нагревании потому, что был расплавленной глобулой с самого начала... Пришлось усилить твердую структуру этого искусственного белка, введя в него гистидины, связывающие ион. И вот этот-то белок-комплексон оказался уже твердым, как природные белки.
 
 
 

Рис.19-15. Основные этапы дизайна четырехспирального пучка, сделанного в группе ДеГрадо. 1. Подбор коротких спиральных пептидов, способных слипаться в тетрамер. 2. Дизайн петель, сшивающих эти пептиды попарно, и отбор тех вариантов сшитых пептидов, что димеризуются. 3. Дизайн последней петли и отбор мономерного тетраспирального искусственного белка. Рисунок взят из [6].

 

       Долгое время все искусственные белки (кроме тех, что усиливались образованием ионных комплексов) представляли собой коллекцию отличных расплавленных глобул. Они обладали прекрасной вторичной структурой, они были очень компактны,  —  но им не хватало твердости.
       Вопрос: Почему хотят сделать нормальный, "твердый" белок  —  а получается расплавленная глобула?
       Видимо, потому, что все знают, как сделать стабильные вторичные структуры (лейцины и аланины, отороченные глутаминовыми кислотами с N-конца и лизинами с С-конца  —  получится a-спираль; побольше валинов, изолейцинов и треонинов  —  получится b-структура); и все знают, как заставить эти a- и b-структуры слипаться: надо сделать на них сплошные поверхности из гидрофобных групп (см. Рис.19-6); и как заставить эти белки не агрегировать: надо сделать противоположные поверхности этих a- и b-структур из гидрофильных групп. Но вот для чего рецептов пока никто не сделал  —  это для создания плотной упаковки боковых групп в гидрофобном ядре белка. Вот эта-то упаковка и не получается. А без нее  —  при наличии слипающихся, но не плотно слипающихся вторичных структур,  —  получается лишь расплавленная глобула...
       Однако, по-видимому, задача дизайна плотной упаковки может быть решена. Имея хороший алгоритм компьютерного перебора астрономического числа возможных упаковок боковых групп и отсечения бесперспективных вариантов, расчет плотной упаковки  —  для маленького белка  —  может быть проведен. По крайней мере, Дахийат и Майо его провели и создали  —  в 97 г.  —  твердый (без всякого дополнительного комплексообразования с ионом) маленький белок (Рис.19-16). Этот белок был создан на основе архитектуры "цинкового пальца" (широко распространенного ДНК-связывающего мотива),  —  но без иона Zn, держащего архитектуру природного цинкового пальца. При этом искусственный белок FSD-1 Дахийата и Майо имеет очень невысокую (20%) гомологию с природным цинковым пальцем,  —  и лишен цинк-связывающего центра. И тем не менее он тверд при низких температурах (его структура исследована при помощи ЯМР). Однако он плавится в довольно широком температурном диапазоне, т.е. заметно менее кооперативно (Рис.19-16г), чем аналогичные ему природные белки.
 
 
 

       Рис.19-16. (а) Структура исходного "цинкового пальца" (второго модуля белка Zif268); ион Zn показан шариком. (б) Структура искусственного белка FSD-1. (в) Спектр КД для FSD-1 при 1^оС. (г) Изменение спектра КД искусственного FSD-1 с температурой. Картинки взяты из B.I.Dahiyat & S.L.Mayo, Science (1997) 278:82-86.
 
 

       Кроме белков, основанных на природных архитектурах, конструируются искусственные белки, чьи архитектуры не имеют природных аналогов.
       В основу искусственного белка альбебетина (Рис.19-17а) положена структура, не обнаруженная еще в природе. Она состоит из двух повторов типа a-b-b (поэтому белок и назван альбебетином), и она не противоречит общим принципам формирования структуры глобулярных белков. Вместе с О.Б.Птицыным, я занимался дизайном альбебетина, а получение и исследование этого белка и его вариантов велось А.Н.Федоровым здесь, в Институте белка, и Д.А.Долгих в группе М.П.Кирпичникова.
 
 
 

       Рис.19-17. Конструируемая пространственная структура альбебетина (а) и схема экспериментально определенной пространственной структуры рибосомального белка S6 (б). Внизу показаны схемы топологий этих белков. Для S6 показана также искусственно введенная пермутация  —  разрезание петли () и соединение исходных N- и С-концов ( N—C ). Такая пермутация придает ему архитектуру, сконструированную для альбебетина.
 
 

       Структурное исследование альбебетина показало, что он обладает заданной вторичной структурой (Рис.19-18а) и компактной, весьма стабильной к разворачиванию мочевиной и к протеолизу пространственной структурой. Однако он кооперативно не плавится и находится скорее в состоянии расплавленной глобулы, чем в твердом.
 
 
 

           а                                     б

       Рис.19-18. (а) Спектр КД альбебетина () и альбеферона (); (б) кривая микрокалориметрического плавления пермутированного, с целью придания ему топологии альбебетина, белка S6. Картинки взяты из D.A.Dolgikh, A.E.Gabrielian, V.N.Uversky & M.P.Kirpichnikov, Appl. Biochem. & Biotech. (1996) 61:85-96, и из Z.Kh.Abdullaev, R.F.Latypov, A.Ya.Badretdinov, D.A.Dolgikh, A.V.Finkelstein, V.N.Uversky & M.P.Kirpichnikov, FEBS Letters (1997) 414:243-246, соответственно.
 
 

       Еще один белок со структурой, запланированной для альбебетина, был получен другим методом,  —  при помощи циркулярной пермутации природного белка S6 (он, как и ряд других белков с недавно расшифрованной пространственной структурой, имеет ту же укладку структурных сегментов, что была разработана для альбебетина, но эти сегменты по-иному соединены белковой цепью, см. Рис.19-17б). Полученный белок обладает твердой, кооперативно плавящейся пространственной структурой (Рис.19-18б).
       Недавно альбебетин был использован в качестве носителя функциональной активности. В него  —  точнее, в новый белок, названый альбефероном  —  был включен фрагмент 131-138 цепи интерферона a2 человека, способный активировать бласт-трансформацию тимоцитов. Собственно говоря, активацию делает именно это фрагмент интерферона, а остальная, уложенная в глобулу цепь этого белка служит как бы ножнами,  —  она защищает фрагмент 131-138 от раскусывания и не дает ему действовать слишком уж активно. Опыты показали, что так же работает и альбеферон.

       Работы по функционально-активным искусственным белкам ведутся во многих группах. Создаются модели фибриллярных белков на основе длинных спиральных пучков. Создана первая "работающая" модель мембранного белка из амфифильных (гидрофобно-гидрофильных) спиралей,  —  эти спирали образуют ионные каналы, причем точечные мутации способны резко менять их селективность. Дали функциональный "белок" и a-спиральные полипептиды, химически пришитые к гему.
       В общем, в настоящее время белки стремительно превращаются из объекта почтительного и изумленного наблюдения в предмет активной инженерной деятельности (но изумление остается...).