В живой клетке белок синтезируется на рибосоме. Биохимический синтез белковой цепи занимает порядка минуты, да и все изготовление "готового", свернутого белка, занимает примерно столько же  —  эксперимент не видит разницы (для справки: весь жизненный цикл бактерии может длиться всего пару десятков минут). Поэтому естественно предположить, что сворачивание белка может начинаться еще на рибосоме, еще до окончания ее полного синтеза всей белковой цепи.
       К сожалению, достоверные экспериментальные данные об образовании белковой структуры in vivo  —  в клетке  —  весьма скудны: очень трудно увидеть структурные превращения растущего белка на фоне всего клеточного супа. Обычно приходится останавливать синтез, выделять "недоделанный" белок, исследовать его отдельно  —  на все уходит время, десятки минут, в течение которых пространственная структура исследуемой белковой цепи может кардинально измениться...
       Ряд такого рода опытов с большими белками показывают, что их первые, N-концевые домены успевают (или, точнее, обладают способностью) свернуться еще до окончания полного синтеза цепи.
       Здесь, однако, надо подчеркнуть, что все данные эти относятся к многодоменными белкам; это существенная оговорка, так как "единицей самоорганизации", по-видимому, является не белок в целом, а его отдельный домен.
       Об этом свидетельствуют два ряда данных, полученных, правда, не in vivo, а in vitro: во-первых, отдельно взятые домены часто способны к правильной самоорганизации; во-вторых, однодоменный белок, лишенный примерно десятка аминокислот на своем С-конце, к самоорганизации не способен.

       Ряд интересных данных по сворачиванию белков получен в бесклеточной белок-синтезирующей системе (т.е. не совсем in vivo, но и не совсем in vitro). Такая система состоит из рибосом, транспортных и информационных РНК и других факторов, необходимых для матричного синтеза белковой цепи.
       К сожалению, и здесь очень трудно увидеть строение растущего белка на фоне громадной рибосомы. Строение, действительно, увидеть трудно. Но, если повезет, можно увидеть активность вновь синтезированного белка.
       Счастливой находкой здесь оказалась люцифераза: этот белок, приняв свою нативную конформацию, катализирует реакцию с испусканием света. Так что появление нативной люциферазы легко увидеть  —  ведь больше в клетке ничего не светится. Исследуя биосинтез и сворачивание этого белка,  —  А.Н.Федоров, В.А.Колб, Е.В.Макеев и А.С.Спирин в нашем институте показали, что первый активный белок появляется через 10 мин. после включения его биосинтеза, а выключение, блокирование биосинтеза немедленно прекращает выход активного белка (Рис.17-1). Это значит, что цепей уже синтезированных, но еще не свернувшихся, практически нет  —  то есть показывает, что сворачивание этого большого, содержащего свыше 500 остатков в цепи белка идет либо котрансляционно, либо почти мгновенно после конца биосинтеза.
 
 
 

       Рис.17-1. Свечение нативной люциферазы, синтезируемой в бесклеточной системе. Время "0"  —  включение биосинтеза люциферазы. Время выключения биосинтеза указано стрелкой. Сразу после этого свечение прекращает свой рост, т.е. выход нового активного белка больше не наблюдается. Картинка взята из V.A.Kolb, E.V.Makeev & A.S.Spirin, EMBO J. (1994) 13:3631-3637.
 
 

       Однако для выяснения не только результата, но и хода процесса самоорганизации приходится исследовать самоорганизацию белка "совсем in vitro" (без всяких рибосом, шаперонов и т.д.),  —  то есть при ренатурации белка в растворе.
       Глобулярный белок способен к спонтанной самоорганизации in vitro (ренатурации), если после биосинтеза он не подвергся сильной химической модификации. В этом случае его архитектура, "мягко" (без разрыва цепи) разрушенная температурой, растворителем и т.д.,  —  спонтанно восстанавливается при "нормализации" среды. Правда, эффективная ренатурация нуждается в тщательном подборе экспериментальных условий  —  иначе ей может воспрепятствовать агрегация белка.
       Явление спонтанной самоорганизации белков было открыто в группе Анфинсена в 1961 г. на бычьей рибонуклеазе А. Это открытие, впоследствии подтвержденное на множестве других белков, а также возможность чисто химического синтеза белковой цепи, спонтанно сворачивающейся далее в активный белок (опыты Меррифилда и др.), позволяет  —  в первом приближении  —  отделить изучение структурообразования белка от изучения биосинтеза белковой цепи.

       Самоорганизация белка in vitro может рассматриваться как самый простой (и поэтому для меня, физика, наиболее интересный) случай "чистой" самоорганизации, когда белку не помогает никто.
       Вообще, самоорганизация пространственных структур белков (а также РНК)  —  уникальное физическое явление, не имеющее аналогов в "неживой" природе. Эта самоорганизация напоминает образование кристаллов,  —  но кристаллов, во-первых, не имеющих периодической пространственной структуры; во-вторых, чрезвычайно сложно устроенных; и, наконец, очень маленьких.
       Самоорганизация белковых структур относится, с физической точки зрения, к классу явлений "возникновение порядка из порядка" (по классификации Пригожина): трехмерный "апериодический кристалл" (говоря словами Шредингера) структуры белка порождается заранее фиксированным порядком звеньев в его цепи. Видимо, следует сразу отметить, что самоорганизация трехмерной структуры белков (и РНК, и кристаллов вообще) возникает из стремления молекул к термодинамическому равновесию  —  и тем принципиально отличается от той самоорганизации типа "порядок из беспорядка" (будь то самоорганизация в осциллирующей химической реакции Белоусова-Жаботинского или самоорганизация в экологической системе "хищник-жертва"), которую обычно имеют в виду, говоря о самоорганизации в неравновесных, работающих на протоке энергии системах.

       Однако прежде, чем перейти к рассказу о самоорганизации белка in vitro, к рассказу о физике этого спонтанного процесса, я хочу кратко упомянуть ту машинерию, которая используется клеткой для повышения эффективности самоорганизации белка.
       Рибосома выдает белковую цепь постепенно и не вполне равномерно  —  есть паузы, приостановки биосинтеза цепи; предполагается, что соответствие пауз границам структурных доменов способствует их спокойному, без вмешательства извне, созреванию.
       Далее. В клетке белковая цепь сворачивается под опекой специальных белков  —  шаперонов. "Малые" шапероны типа hsp70 (heat shock protein, 70 килодальтон) связываются с белком, предохраняя его от агрегации, а потом сбрасываются (на что расходуется АТФ). "Большие" шапероны типа GroEL и GroES или TriC работают в основном с многодоменными белками, и особенно  —  с белками, чьи домены составлены из отдаленных кусков цепи. Эти шапероны образуют как бы пробирку (диаметром в несколько нанометров  —  и с крышечкой!), куда поступает новосинтезированный (и предварительно облепленный шаперонами типа hsp70 и/или hsp40) белок или его домен. Эта "пробирка" (иногда ее называют "ячейкой Анфинсена") защищает новорожденный белок и от агрегации, и от действия концентрированного клеточного "супа". При этом пробирка "трясется" и время от времени активно открывается (на что расходуется АТФ) и закрывается,  —  но отпускает она белок только тогда, когда он уже свернется и перестанет липнуть к пробирке.
       Кроме того, самоорганизация белков может ускоряться некоторыми ферментами типа пролил-изомеразы (катализирующей медленно само по себе идущее превращение trans пролинов в cis и обратно) или дисульфид-изомеразы (катализирующей сшивание и расшивание SS связей).
       Однако опыт показывает, что работа всей этой клеточной машинерии может быть заменена подбором соответствующих внешних условий (малой концентрации белка, нужного окислительно-восстановительного потенциала). Эта замена не меняет результат сворачивания: уж если белок не выпал в осадок, а свернулся in vitro  —  то он свернулся в ту же структуру, что и in vivo. Правда, часто это займет больше (а иногда  —  и меньше!) времени, чем самоорганизация in vivo,  —  но результат будет тот же.
       Все это показывает, что вся необходимая для построения трехмерной структуры белка информация содержится в химической последовательности аминокислот в его цепи.
       Похоже, что  —  помимо самого синтеза белковой цепи — биосинтетический аппарат клетки (рибосома + шапероны + ...) служит лишь чем-то вроде инкубатора для сворачивания пространственной структуры белка: этот "инкубатор" не определяет структуру белка, но он создает условия для ее созревания,  —  так же, как обычный инкубатор обеспечивает выведение птенца, не предопределяя, кто выведется  —  цыпленок или утенок.

       Загадочность самоорганизации белков (и РНК) суммируется "парадоксом Левинталя". Загадка состоит вот в чем. У белковой цепи есть бездна возможных конформаций (каждый аминокислотный остаток имеет около 10 возможных конформаций, то есть цепь из 100 остатков  —  порядка 10¹⁰⁰ возможных конформаций). Так что белок должен искать "свою" пространственную структуру среди порядка 10¹⁰⁰ возможных. И так как переход из одной конформации в другую занимает ~10^-13 секунды как минимум, перебор всех 10¹⁰⁰ структур должен был бы занять порядка 10⁸⁰ лет, на фоне которых время жизни нашей Вселенной  —  10¹⁰ лет  —  величина бесконечно малая... Вопрос: как белок может "найти" свою структуру за минуты?
       Парадокс же заключается в следующем. С одной стороны, нативная пространственная структура по всем тестам ведет себя как самая стабильная из всех структур цепи: белковая цепь попадает в нее при разных кинетических процессах [и при сворачивании на рибосоме в процессе биосинтеза, и после секреции сквозь мембрану, и при сворачивании в пробирке (ренатурации),  —  чем бы и как бы она ни была в этой пробирке развернута]. С другой стороны, нет никаких гарантий, что эта структура  —  самая стабильная из всех возможных: у белковой цепи просто нет времени на то, чтобы убедиться в этом!
       Как же белок выбирает свою нативную структуру среди бесчисленного множества возможных?  —  спросил Левинталь, и ответил:  —  По-видимому, самоорганизующийся белок следует по какому-то специальному "пути сворачивания", и та структура, где этот путь заканчивается, и является его нативной структурой. Иными словами, Левинталь предположил, что нативная структура белка определяется не стабильностью, не термодинамикой, а кинетикой, т.е. она соответствует не глобальному, а просто быстро достижимому минимуму свободной энергии цепи.
       Вопрос о том, что именно  —  кинетика или термодинамика  —  определяет укладку белковой цепи  —  отнюдь не чисто умозрительный. Он постоянно возникает на пути решения конкретных задач физики белка,  —  идет ли речь о предсказании структуры белка по его аминокислотной последовательности (надо знать, что предсказывать: самую стабильную или самую быстро сворачивающуюся его структуру), или о дизайне новых, не встречающихся в природе белков (надо знать, что делать: максимально усиливать стабильность желаемой структуры или пролагать максимально быстрый путь к ней).

       Обсуждение механизма сворачивания белков началось сразу же после расшифровки первых трехмерных структур и открытия явления самоорганизации. Первой, видимо, была гипотеза Филлипса, согласно которой на N-конце растущей цепи (с которого начинается биосинтез белка) возникает зародыш структуры, и остальная цепь наматывается на него. В той или иной форме такая точка зрения присутствует в ряде работ и по сей день. Однако она не подтвердилась. В изящных работах Гольденберга и Крейтона было показано, что N-конец цепи не играет решающей роли в самоорганизации in vitro. Замкнутая в кольцо цепь небольшого белка, ингибитора трипсина, сохраняет способность к самоорганизации; и даже если разрезать это кольцо так, что новым N-концом окажется бывшая середина цепи  —  самоорганизация ведет к прежней пространственной структуре.

       В поисках пути к решению проблемы самоорганизации белков, О.Б.Птицын в 1973 году предложил концепцию стадийного сворачивания белка (Рис.17-2). В рамках этой гипотезы, получившей позже название "framework model" ("каркасной модели"), и проходило, в значительной мере, дальнейшее обсуждение проблемы самоорганизации белка в мировой научной литературе.
 
 
 

       Рис.17-2. Стадийная модель сворачивания белка по О.Б.Птицину (1973). Выделены вторичные структуры  —  a-спирали (цилиндры) и b-участки (стрелки).
 
 

       Эта модель постулировала последовательное вовлечение различных взаимодействий в формирование структуры белка и подчеркивала важность образования зародышевых a-спиралей и b-шпилек на ранних стадиях сворачивания, слипания этих зародышей в глобулу, грубо напоминающую нативную, и окончательной "доводки" строения глобулы на последнем этапе самоорганизации.
       Ключевым камнем этой концепции было то, тогда чисто гипотетическое, а теперь вошедшее в учебники состояние белковой цепи, которое ныне известно как "расплавленная глобула".
       Выведенная буквально "на кончике пера", расплавленная белковая глобула была затем экспериментально обнаружена и детально исследована Долгих, Семисотновым, Гильманшиным и др. в лаборатории Птицына в 80-х годах,  —  первоначально как равновесное состояние "слабоденатурированного" белка (об этом я говорил на прошлой лекции), а потом и как кинетический интермедиат сворачивания белка in vitro.
       Так, расплавленная белковая глобула накапливается в процессе ренатурации карбоангидразы В (Рис.17-3). Видно, что "нативные" значения приведенной вязкости (характеризующей объем глобулы) и эллиптичности при 222 нм (характеризующей наличие вторичной структуры) восстанавливаются в процессе ренатурации значительно быстрее, чем эллиптичность при 270 нм (характеризующая упаковку боковых групп) или активность белка. Это говорит о существовании кинетического интермедиата,  —  причем интермедиата, являющегося расплавленной глобулой: его компактность и вторичная структура близки к таковым для нативного белка, однако он не имеет нативной упаковки боковых групп и эстеразной активности нативного ("твердого") белка.
 
 
 

       Рис.17-3. Кинетика восстановления "степени нативности" f_N в процессе ренатурации карбоангидразы В. Переход белка из полностью развернутого состояния (существовавшего при 5,45 М гуанидингидрохлорида) в нативное (при 0,97 М гуанидингидрохлорида) наблюдается по различным параметрам: приведенной вязкости , эллиптичности при 222 нм  и 270 нм ( ^_______ ) и энзиматической активности (о о о). Картинка взята из D.A.Dolgikh, A.P.Kolomiets, I.A.Bolotina & O.B.Ptitsyn, FEBS Letters (1984) 164:88-92.
 
 

       Расплавленная глобула оказывается  —  в физиологических условиях  —  ранним промежуточным состоянием на стартующем из клубка пути самоорганизации многих глобулярных белков in vitro. Для образования такого интермедиата достаточно миллисекунд, полное же восстановление свойств нативного белка из 100-300 аминокислотных остатков требует от секунд (для одних белков) до десятков минут (для других).
       Необходимо подчеркнуть, что самый медленный (rate-limiting) шаг самоорганизации приходится не на раннюю стадию, не на образование расплавленной глобулы, а на образование из нее плотно упакованной, нативной глобулы (Рис.17-3).
       Все описанные выше работы велись, как теперь говорят, в рамках "химической логики", императив которой  —  "ищи и выделяй промежуточные состояния!". В химии это обычно позволяет понять, как протекает реакция. Но при изучении самоорганизации белков эта логика не сработала: интермедиаты были определены, но ключевые вопросы остались без ответа.

       Тогда обратились к маленьким (из 50-100 остатков) белкам, сворачивающимся in vitro без наблюдаемых, "накапливающихся" в эксперименте интермедиатов, и начали исследовать их более интенсивно. И первая неожиданность, с которой здесь столкнулись,  —  оказалось, что эти белки порой сворачиваются очень быстро  —  много быстрее тех, наличие интермедиатов в сворачивании которых должно было, казалось бы, ускорить и облегчить их правильное сворачивание!
       Обычно белки "однодоменного" размера сворачивались за секунды или десятки секунд, но некоторые из этих белков (правда, это были маленькие белки  —  до 100 остатков длиной) сворачивались  —  полностью, до нативной структуры, без наблюдаемых накапливающихся промежуточных структур  —  за миллисекунды (Рис.17-4). Это регистрировалось по одинаковой скорости восстановления вторичной структуры, упаковки боковых групп, флюоресценции триптофанов (зависящей от их погруженности в глобулу), обмениваемости водородов в белке и т.д.
 
 
 

       Рис.17-4. Ренатурация ACBP (белка, связывающего ацил-коэнзим А), регистрируемая по восстановлению эллиптичности при 225 нм (а) и 286 нм (б). Тонкая, ломаная линия  —  экспериментальный сигнал, жирная кривая  —  результат его сглаживания, с учетом погрешности опыта. Картинки взяты из Kragelund B.B., Robinson C.V., Knudsen J., Dobson C.M. & Poulsen F.M. Biochemistry (1995) 34: 7217-7224.
 
 

       Однако,  —  что в таких экспериментах можно исследовать, чтобы пролить свет на природу процесса самоорганизации? Ведь интермедиатов, которые можно выделить и изучать, тут нет?!
       Ответ: здесь можно изучать переходное состояние  —  состояние, играющее ключевую роль в кинетике процесса.

       Напомню, что кинетика перехода между двумя непосредственно наблюдаемыми состояниями (А и В на Рис.17-5) успешно описывается теорией переходных состояний  —  которая в химии обычно называется теорией активированных комплексов. Суть ее сводится к тому, что скорость процесса лимитируется переходным состоянием #, т.е. наименее (по термодинамике) вероятным (и потому не накапливающимся и непосредственно не наблюдаемым), но необходимым промежуточным состоянием пути из А в В,  —  или, иными словами, что кинетика переходов А®В (и В®А) определяется высотой максимума свободной энергии на пути, соединяющем А и В.
 
 
 

       Рис.17-5. Преодоление свободно-энергетического барьера # при переходе из состояния "А" в состояние "В" (стрелка слева) и из "В" в "А" (стрелка справа). F_A, F_В и F^#  —  свободные энергии состояний А, В и "переходного" (барьерного, имеющего максимальную свободную энергию на пути процесса) состояния #.
 
 

       При этом скорости перехода из А в В и из В в А суть
 

kА®В = k0 exp[-(F#-FA)/RT] kВ®А = k0 exp[-(F#-FВ)/RT].

(17.1)

Здесь F_A, F_В и F^#  —  свободные энергии состояний А, В и "переходного" # (Рис.17-5), а k₀  —  быстрота "элементарного шага" процесса, за которую часто принимают частоту теплового колебания RT/h (где h  —  постоянная Планка; при "обычных" температурах T~300^oK, RT/h ~ 10¹³ сек^-1),  —  с такой частотой, под воздействием тепловых колебаний, молекула предпринимает попытки преодолеть активационный барьер #.
       Уравнения (17.1) применимы только к процессам, протекающим за время, много-много большее, чем время элементарного шага. И именно с такими процессами мы имеем дело при сворачивании белков.
       Напомню, откуда следуют соотношения (17.1). Рассмотрим процесс А « # ® В. Так как "проток" молекул через барьер # идет медленно по сравнению со скоростью элементарного шага, то состояние # находится почти в термодинамическом равновесии с состоянием А. Иными словами, если в исходном состоянии А находится n молекул, то, по распределению Больцмана, в барьерном состоянии # находится  n^#  =  n exp[-(F^#-F_A)/RT] молекул. За время "элементарного шага" они скатятся с барьера #  —  половина в сторону А, половина в сторону В [а на их место придет примерно столько же (n^#) молекул со стороны А  —  так что населенность # практически не изменится, будет квазистационарной]. Иначе говоря, для перехода половины всех n молекул через барьер в сторону В потребуется время, в (n/2)/(n^#/2) = exp[+(F^#-F_A)/RT] раз превосходящее время элементарного шага. А поскольку время элементарного шага t₀є1/k₀, то характерная скорость реакции А « # ® В есть k_А®В = k₀ exp[-(F^#-F_A)/RT], а ее характерное время,  —  время, за которое около половины всех молекул перейдет из А в В,  —  есть
 

tА®В = 1/kА®В = (1/k0) exp[+(F#-FA)/RT].

(17.2)

       Это же объяснение распространяется, естественно, и на k_В®А.
       Важно, что температурная зависимость скорости реакции дает возможность судить об энергии переходного состояния. Для этого, согласно Аррениусу, вычисляют производную логарифма скорости реакции по обратной температуре (1/T):
 

d[ln(kА®В)] / d(1/T) = d[ln(k0) - (F#-FA)/RT]/(-T-2dT) ®  - (E#-EA)/R .

(17.3)

       Здесь я воспользовался уже известной нам формулой d(F/T)/dT =  - E/T ² и пренебрег очень слабой зависимостью скорости элементарного шага от температуры. Последнее допустимо даже в простых химических реакциях, и тем более допустимо в белках, где энергии E^# и E_A  —  велики, так как определяются взаимодействиями множества частиц.

       Рисунок 17-6 показывает изменение скорости сворачивания и разворачивания лизоцима при его тепловой ре- и денатурации.
 
 
 

       Рис.17-6. Аррениусовы графики для зависимости скорости тепловой денатурации и ренатурации лизоцима от обратной температуры (Т^-1); графики взяты из статьи S.Segava & S.Sugihara, Biochemistry (1984) 23:2473-2488. Константы скорости (k) измеряются в сек^-1. Ренатурация, скорость k_u®N (эксперимент: точки о, и тонкая интерполяционная кривая); денатурация, скорость k_N®u (эксперимент: точки ·, и жирная интерполяционная кривая). Середине плавления отвечает та температура, при которой k_u®N = k_N®u, т.е. где кривые пересекаются (около 1000/3.08 = 325^оК). При меньших температурах (т.е. при больших Т^-1  —  справа от точки пересечения) превалирует сворачивание, при больших температурах (т.е. при меньших Т^-1, слева от точки пересечения)  —  идет разворачивание.
 
 

       Он показывает, что в самой середине перехода [там, где скорость сворачивания (k_u®N) равна скорости разворачивания (k_N®u), так что кривые для ln(k_u®N) и ln(k_N®u) пересекаются]  —  скорости обоих процессов близки к е^-2.5 » 0.1 сек^-1 (т.е. что здесь времена протекания и де-, и ренатурации  —  порядка 10 сек).
       Кроме того, эта картинка показывает, что денатурация ускоряется по мере углубления в "область денатурации", а ренатурация ускоряется по мере углубления в "область ренатурации". И здесь содержится одна очень любопытная вещь.
       Она состоит в том, что скорость тепловой денатурации k_N®u падает с Т^-1 (т.е. что она растет с температурой Т, что обычно для физико-химических реакций), а скорость сворачивания k_u®N  —  наоборот, растет с Т^-1 (т.е. она падает с температурой, что необычно для физико-химических реакций). По формуле (17.3) это означает, что E^#-E_N > 0, а E^#-E_u < 0. Иначе говоря, E_u > E^# > E_N, т.е. энергия барьера, E^#, лежит выше энергии нативного состояния, E_N, но ниже энергии развернутого состояния, E_u (последнее необычно для химических реакций, где барьер по энергии выше чем и начальное, и конечное состояние реакции). Дальнейший анализ этого графика показывает, что такое же соотношение, S_u > S^# > S_N, справедливо и для энтропий развернутого, переходного и нативного состояний при сворачивании белка. Это значит, что барьер между нативным и развернутым состояниями белка выглядит "обычным", энергетическим барьером,  —  если глядеть на него со стороны нативного состояния, и что он выглядит необычным, энтропийным барьером,  —  если глядеть на него со стороны развернутого состояния.
       Впрочем, этого можно было ожидать, исходя из сделанного на прошлой лекции анализа свободно-энергетического барьера и причин фазового, типа "все-или-ничего" перехода между нативным и денатурированным состоянием белка (см. Рис.17-7, который воспроизводит уже известную вам схему изменения энергии, энтропии и свободной энергии по мере расширения глобулы).
 
 
 

       Рис.17-7. Изменение энергии E, энтропии S и свободной энергии F=E-TS с изменением плотности глобулы. D  —  денатурированное состояние (в данном случае  —  расплавленная глобула, так как плотность его велика), N  —  нативная глобула, #  —  "барьер", максимум свободной энергии на пути равномерного расширения глобулы (от N к D).
 
 

       Обратимся еще раз к уравнениям (17.1). Они показывают, что отношение скоростей прямой и обратной реакций, k_А®В/k_В®А, есть просто константа равновесия между финальным (В) и начальным (А) состояниями
 

КВ:А = kА®В/kВ®А = exp[-(FВ-FA)/RT] .

(17.4)

       Величина константы равновесия К_В:А есть n_B^Ґ/n_А^Ґ, она показывает то соотношение между финальным числом n_B^Ґ молекул в состоянии В и их финальным числом n_A^Ґ в состоянии А, к которому, в конечном итоге (при стремящемся к бесконечности времени наблюдения), приходит процесс при данных условиях (температуре и т.д.).
       С какой скоростью система приходит к этому равновесному состоянию? Для ответа решим соответствующее дифференциальное уравнение:
 

dnA/dt =  - kА®В nA + kB®A nB

(17.5)

(второе уравнение, для dn_B/dt, писать не надо, т.к. n_A+ n_B є n₀, где n₀ —  полное число молекул, т.е. dn_В/dt є -dn_А/dt). Ответ  —  позвольте мне написать его без выкладок, а вам я рекомендую сделать их самостоятельно  —  таков:
 

nA(t) = [nA(0)  —  nАҐ] exp[-(kА®В + kB®A)t] + nАҐ .

(17.6)

       Здесь n_A(t)  —  число молекул в состоянии А в момент времени t от начала процесса, а n_А^Ґ = n₀^.[k_В®А / (k_А®В + k_В®А)]   —  конечное, равновесное число молекул в состоянии А.
       Значит, видимая (apparent) скорость приближения к равновесию есть
 

kapp = kА®В + kВ®А ,  —

(17.7)

она равна сумме скоростей прямой и обратной реакций. Обратите внимание, что эта скорость зависит только от условий, в которых протекает релаксация, и не зависит от исходного распределения белковых молекул между нативным и денатурированным состояниями [т.е. от исходной доли n_A(0)].
       В этой суммарной скорости k_app доминирует более быстрая реакция.
       Если условия (температура и т.д.) отвечают большей устойчивости нативного состояния,  —  то в k_app = k_u®N + k_N®u  доминирует k_u®N, скорость сворачивания. Если более устойчиво денатурированное состояние,  —  то в k_u®N + k_N®u доминирует k_N®u, скорость разворачивания.
       Большим преимуществом измерения скорости прихода к равновесию, k_app, является то, что она всегда может быть измерена (в отличие от k_u®N и k_N®u в отдельности),  —  как тогда, когда более стабильно нативное состояние, так и тогда, когда более стабильно денатурированное.
       При измерении k_app строятся так называемые "шевронные графики" (Рис.17-8). Они так называются из-за своей характерной V-образной формы, напоминающей шевроны на военных кителях. Один взгляд на этот график показывает, что скорости сворачивания (k_u®N) и разворачивания (k_N®u) зависят от концентрации денатуранта противоположным образом. С аналогичной ситуацией мы уже сталкивались, когда изучали температурную зависимость скоростей сворачивания и разворачивания белка. Как и тогда, наблюдаемая здесь противоположность наклонов означает "промежуточность" свойств переходного состояния, их среднее положение между свойствами нативного и развернутого белка.
 
 
 

       Рис.17-8. "Шевронный график" зависимости k_app = k_u®N + k_N®u, видимой характерной скорости приближения к равновесию между нативной и развернутой формами белка (лизоцима куриного яйца), от концентрации гуанидингидрохлорида. Заполненные кружки получены при разбавлении раствора GdmCl, в котором изначально находился денатурированный белок, т.е. при полной или частичной ренатурации белка. При этом k_app » k_u®N. Пустые кружки получены при добавлении GdmCl к изначально нативному белку, т.е. при полной или частичной его денатурации. При этом k_app » k_N®u. Пунктир показывает экстраполяцию величин k_u®N и k_N®u в области излома шеврона. Отклоняющиеся от экстраполяционной прямой точки в верхней левой части графика (т.е. вдали от точки излома, от точки денатурации белка) свидетельствуют либо о какой-то перестройке переходного состояния, либо о появлении каких-то дополнительных метастабильных интермедиатов (возможно, типа расплавленных глобул), которые могут лежать как на, так и вне основного пути сворачивания. Обратите внимание, что все эти перестройки и/или интермедиаты не повышают скорость сворачивания по сравнению с той, что можно было бы ожидать при неизменности переходного состояния: отклоняющиеся точки лежат ниже интерполяционной прямой. Картинка, с небольшими изменениями (добавлены экстраполяционные пунктиры) взята из T.Kiefhaber Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:9029-9033.
 
 

       Действительно, то, что денатурант вообще разворачивает белок, показывает, что он сильнее притягивается к развернутому белку, чем к нативному. То, что денатурант замедляет сворачивание исходно развернутого белка (см. спад скорости в левой части Рис.17-8) показывает, что он сильнее притягивается к исходному, развернутому белку, чем к переходному состоянию; а то, что денатурант ускоряет разворачивание исходно нативного белка (см. подъем скорости в правой части Рис.17-8),  —  показывает, что он сильнее притягивается к переходному состоянию, чем к исходному, нативному. Это означает, что контакт переходного состояния с денатурантом больше, чем у нативного белка, но меньше, чем у денатурированного. Иначе говоря, приведенный на Рис.17-8 шевронный график показывает, что переходное состояние по степени контакта с растворителем, т.е. по своей компактности находится где-то на полпути между развернутым и нативным состояниями белка. Этот график дает даже больше: так как наклон для k_N®u несколько меньше, чем для k_u®N, то компактность переходного состояния несколько ближе (в данном случае) к оной у нативного белка, чем у денатурированного.
       Рисунок 17-8 относится к лизоциму  —  белку, денатурация которого гуанидингидрохлоридом приводит прямо к образованию клубка, а не расплавленной глобулы. При умеренных концентрациях денатуранта (при не очень сильном его разбавлении водой) лизоцим сворачивается довольно медленно, за многие минуты. Однако при самоорганизации в почти чистой воде (происходящей при сильном разведении водой крепкого раствора гуанидингидрохлорида, где находились клубкообразные белковые цепи), скорость сворачивания лизоцима максимальна,  —  и уже слабо зависит от остаточной концентрации денатуранта. При этом в сворачивании лизоцима появляется компактный метастабильный интермедиат типа расплавленной глобулы,  —  интермедиат, который не наблюдается при повышенных концентрациях денатуранта. Появление компактных метастабильных интермедиатов сворачивания, вообще говоря, всегда "выполаживает" зависимость скорости сворачивания от содержания денатуранта  —  см. левый край Рис.17-8. Известно, что ренатурация белка, стартующая не от клубка, а от расплавленной глобулы (например, ренатурация карбоксиангидразы), также демонстрирует довольно слабую зависимость скорости ренатурации от концентрации денатуранта. Последнее означает, что переходное состояние в таком сворачивании мало отличается от исходной расплавленной глобулы по компактности.

       Иначе говоря, переходное состояние  —  по "промежуточности" некоторых своих свойств между свойствами нативного и развернутого белка  —  напоминает расплавленную глобулу. Но это не означает, что переходное  —  подчеркнем, нестабильное  —  состояние действительно похоже на расплавленную глобулу. Эксперимент показывает скорее, что переходное состояние можно представить себе (если речь идет о переходе "клубок ® нативный белок") как частично свернутый нативный белок, остальная часть которого все еще находится в денатурированном, клубкообразном состоянии. Вид переходного состояния для переходов типа "расплавленная глобула ® нативный белок" (или "клубок ® расплавленная глобула ® нативный белок") еще не установлен экспериментально, но весьма правдоподобно, что оно включает часть нативной глобулы, в то время как прочая цепь находится в состоянии расплавленной глобулы.

       Природу переходного состояния удалось выяснить с помощью белковой инженерии. Применяя множество мутаций, и анализируя соответствующие им изменения в шевронных графиках (см. Рис.17-8, 17-9), удается  —  ценой колоссального труда  —  узнать, какие именно остатки вовлечены в "нативоподобную" часть переходного состояния, а какие  —  нет. Этот метод был разработан А. Ферштом а Англии. Строго говоря, пока что он применяется только к белкам, денатурация которых приводит прямо к образованию клубка, а не расплавленной глобулы.
 
 
 

       Рис.17-9. Схема, иллюстрирующая сдвиг "шевронного графика" при мутации. Жирная линия: исходный белок; тонкая  —  мутант. Пунктир показывает экстраполяцию величин k_u®N и k_N®u в области излома шеврона. С₀  —  концентрация денатуранта, соответствующая середине денатурационного перехода в исходном белке. На графике показаны измеряемые в этом опыте величины. Одна из них определяет влияние мутации на высоту свободно-энергетического барьера, стоящего на пути из развернутого состояния в нативное: D(F^#-F_u) = -RTDln[k_u®N]. Вторая  —  ее влияние на стабильность белка, т.е. на разность свободных энергий нативного и денатурированного состояний: D(F_N-F_u) = -RTDln[k_u®N/k_N®u]. Показанные на графике величины относятся к концентрации денатуранта C₀, где требующаяся экстраполяция минимальна (а потому минимальны и погрешности в ней),  —  но, ценой несколько большей экстраполяции (до C₀=0), так обычно определяются изменения в стабильности нативного белка, D(F_N-F_u), и в высоте барьера, D(F^#-F_u), относящиеся к чистой воде.
 
 

       Для оценки вовлеченности остатка в переходное состояние (или, как говорят, в "зародыш" сворачивания белка), оценивают, по сдвигу шеврона, влияние мутации данного остатка на (а) скорость сворачивания белка и (б) на его стабильность. Измеряемые величины показаны на Рис.17-9.
       Скорость сворачивания белка (перехода U®N) определяется (см. формулу 17.1) разностью свободной энергии "зародыша" (#) и исходного развернутого (U) состояния белка (т.е. величиной F^#-F_u).
       Если мутация остатка так же влияет на величину F^#-F_u, как она влияет на стабильность всего нативного состояния (т.е. на величину F_N-F_u),  —  то это свидетельствует о том, что рассматриваемый остаток так же вовлечен в "зародыш" (образует там те же контакты, имеет ту же конформацию и т.д.), как он вовлечен в нативную глобулу.
       Если, наоборот, мутация остатка оказывает влияние только на стабильность белка (т.е. на величину F_N-F_u), но не на скорость сворачивания (т.е. она не влияет на величину F^#-F_u),  —  значит, этот остаток не вовлекается в глобулярный "зародыш" сворачивания, т.е. что он входит в нативную белковую глобулу только уже после образования зародыша.
       И, наконец, если мутация остатка сильно влияет на стабильность белка и слабее (но с тем же знаком)  —  на стабильность зародыша,  —  значит, этот остаток образует в зародыше только часть тех контактов, которые имеет в нативном белке.
       Так очерчивается зародыш сворачивания белка (Рис.17-10): для каждого из мутированных остатков цепи вычисляется величина
 

Ff = D(F#-Fu)/D(FN-Fu) ,  —

(17.8)

и, если для данного остатка F_f  близка к 1,  —  то говорят, что он входит в зародыш структуры; а если F_f  близка к 0  —  то нет.
 
 
 

       Рис.17-10. Структура переходного состояния белка CheY, согласно T.Lpez-Hernndes & L.Serrano, Folding & Design (1996) 1:43-55. На фоне нативной укладки цепи CheY синими шариками выделены остатки, вовлеченные в переходное состояние (образующие там более 30% своих контактов), желтыми шариками  —  не вовлеченные в переходное состояние остатки. Без шариков оставлены те области цепи, где мутации еще не делались. Красным закрашены остатки цепи, сложные для интерпретации,  —  у них столь малы величины D(F^#-F_u) и D(F_N-F_u) (последнее важнее, так как эта величина стоит в знаменателе в формуле 17.8), что погрешности в их определении превышают сами эти величины.
 
 

       Замечательно, что лишь очень малое число остатков в белке не удается проинтерпретировать с такой точки зрения (а с нее не удалось бы проинтерпретировать такие остатки, чьи F_f  величины лежали бы вне интервала 0  —  1, т.е. те остатки, мутации которых влияли бы только на скорость сворачивания, но не на стабильность нативной структуры; или те, что стабилизировали бы только зародыш, но дестабилизировали бы нативный белок, и т.д.).
       Это вселяет уверенность в том, что базовая картина, согласно которой остатки  —  уж если они вовлечены в зародыш  —  стоят там так же, как в нативном белке,  —  эта картина в основном справедлива.
       Рисунок 17-10 показывает, что остатки, наиболее существенные для сворачивания белка, группируются в компактный "доменчик", компактное ядрышко сворачивания, причем оно лежит не в геометрическом центре белка, а сдвинуто к его поверхности. Аналогичная картина наблюдается и в других (впрочем, пока немногочисленных) белках, исследованных на предмет местоположения их ядер сворачивания.

       В заключение я хочу вернуться к Рис.17-8 и подчеркнуть, что даже для совершенно конкретного белка не существует четко определенного "характерного времени сворачивания". Действительно, этот рисунок показывает, что сворачивание лизоцима занимает порядка 0.1 сек в нативных условиях, и порядка 10000 сек  —  в условиях созданного гуанидингидрохлоридом (при той же температуре раствора) равновесия нативной и денатурированной форм. А в других условиях, при повышенной температуре, но без гуанидингидрохлорида, области равновесия этих форм отвечает (см. Рис.17-6) время сворачивания порядка 10 сек. Так что, обсуждая скорость сворачивания белка, мы должны иметь в виду либо весь наблюдаемый диапазон времен сворачивания данного белка, либо совершенно конкретные экспериментальные условия  —  например, те условия, при которых белок сворачивается в клетке.