Начнем с a-спиралей. Первая водородная связь в ней, (СО)₀  —  (HN)₄, фиксирует конформации трех остатков  —  1, 2, 3; следующая водородная связь, (СО)₁  —   (HN)₅, дополнительно фиксирует конформацию только одного остатка  —  остатка 4; связь (СО)₂  —  (HN)₆ дополнительно фиксирует остаток 5, и т.д.
 

       Значит, если в спирали фиксировано n остатков, то их фиксирует n-2 водородные связи. Рассмотрим свободную энергию образования такой спирали из клубка в водном окружении ("клубок"  —  это полимер без структуры и без взаимодействия дальних по цепи звеньев). Эту свободную энергию можно записать как
 

DFa = Fa  —  Fклуб. = (n-2)fH  — nTSa =  -2fH + n(fH  —TSa)

(9.1)

Здесь f_H  —  свободная энергия водородной связи в a-спирали (вы помните, что f_H  —  не просто энергия, как было бы в вакууме: в нее входит и энергия, и энтропия перестроек водородных связей в водном окружении), а S_a  —  потеря энтропии при фиксации одного остатка в спирали.
       Вы видите, что в DF_a есть два члена. Один (-2f_H) не зависит от длины спирали; величина
 

fINIT =  -2fH

(9.2)

традиционно называется свободной энергией инициации спирали (на самом деле, f_INIT  —  суммарная свободная энергия обеих границ спирали с клубком   —  учитывает и инициацию, и терминацию спирали). Другой член, n(f_H-TS_a), прямо пропорционален длине спирали; величина
 

fEL = (fH-TSa)

(9.3)

называется свободной энергией элонгации спирали на один остаток. В общем виде,
 

DFa = fINIT + n.fEL .

(9.4)

При этом отношение вероятности чисто спирального состояния цепи из n остатков к ее же чисто клубковому (и начисто лишенному спиральных примесей) состоянию, равно
 
 

exp(-DFa/kT) = exp(-fINIT/kT).[exp(-fEL/kT)]n = ssn

(9.5)

Здесь я использовал общепринятые обозначения:
       —  фактор элонгации спирали: s = exp(-f_EL/kT);
       —  фактор инициации спирали: s = exp(-f_INIT/kT);
ясно, что s<<1, так как s = exp(-f_INIT/kT) = exp(+2f_H/kT); а свободная энергия водородной связи  —  большая отрицательная величина, порядка нескольких kT.

       Прежде, чем говорить о том, как экспериментально определяются величины s и s,  —  выясним общий вопрос о том, как образуется спираль при изменении условий среды (температуры, растворителя и т.д.)  —  переходом "все-или-ничего" или постепенно?

       Поначалу кажется, что такая отличная от клубка структура, как спираль, должна "вымораживаться" из него путем фазового (т.е. "все-или-ничего") перехода  —  как лед из воды...
       Однако на этот счет есть теорема Ландау, которая гласит, что в системе, где обе фазы одномерны,  —  фазовый переход первого рода невозможен. Попытаюсь объяснить эту теорему.

       Прежде всего  —  что значит "одномерность". Это значит, что размер границы, "стыка" фаз не зависит от размера кусков этих фаз. В этом смысле и спираль, и клубок в полимере  — одномерны. Рисунок 9-1 поясняет, что граница (стык) спирали и клубка не зависит ни от длины спирали, ни от длины клубка,  —  в то время как поверхность, граница трехмерной фазы (например, льдинки в воде) зависит от ее размера. Соответственно, свободная энергия границы спирали и клубка не зависит от их длин, а свободная энергия поверхности трехмерной фазы растет как n^2/3 с ростом числа n вовлеченных в нее частиц.
 
 
 

       Рис.9-1. Сравнение одномерной (клубок со спиралями) и трехмерной (льдинка в воде) систем. Размер стыка спирали и клубка не зависит их длин; поверхность трехмерной льдинки зависит от ее размера.
 
 

       Теперь  —  что значит "происходит как фазовый переход первого рода". Это значит, что при температуре перехода стабильной может быть либо одна, либо другая фаза, но перемешивание фаз (например, льда и воды) ведет к повышению свободной энергии, и потому нестабильно. Здесь вас не должна вводить в искус картина плавающего в воде льда: при любой температуре такое состояние неустойчиво (из-за повышенной свободной энергии на границе воды со льдом), и со временем лед или растает, или охватит всю воду  —  конечно, если нет тока подземного тепла, течений и других неравновесных вещей...
       Выгодно ли сосуществование фаз в трехмерной системе? Нет. Почему? Обратимся опять к Рис.9-1. Рассмотрим температуру, где безграничная вода и безграничный лед имеют равную свободную энергию (это и есть условие "точки перехода"). Если в воде плавает льдина из n молекул, свободная энергия границы пропорциональна xn^2/3, где n^2/3  —  характерное число пограничных молекул, а x>0  —  энергия границы в расчете на одну из них. (Замечание. Если x<0, "перемешивание"  —  оно при этом всегда термодинамически выгодно  —  произойдет на молекулярных масштабах, и двух фаз не будет вообще). Значит, поверхность льдинки повышает свободную энергию на xn^2/3. Правда, льдинка имеет еще позиционную энтропию, так как может находиться в разных точках сосуда. Но эта энтропия не превосходит величину порядка k^. ln(N), если в сосуде  —  всего N молекул (т.е. N точек, с которых может начинаться льдинка). Итого  —  свободная энергия льдинки  —  порядка [xn^2/3 - kТ^.ln(N)]. Но логарифм  —   очень "слаборастущая" при больших N функция. Если льдинка занимает заметную часть сосуда (скажем, n~N/10), и N очень велико [скажем, 10 000 000 000], то ln(N) [в данном случае - 23] очень мал по сравнению с (N/10)^2/3 [в данном случае - с 1 000 000],  —  то есть в свободной энергии льдинки доминирует граничный член xn^2/3, а он противится ее образованию... Поэтому в трехмерной системе макроскопические фазы разделяются ("льдинки" из нескольких молекул  —  не в счет: это просто микроскопические, локальные флуктуации), и фазовый переход первого рода в ней возможен.
       А выгодно ли сосуществование фаз в одномерной системе? Оказывается, да. Рассмотрим опять температуру "середины перехода", где спираль и клубок имеют равную свободную энергию, т.е. где f_EL=0. Свободная энергия обеих границ спирали и клубка, f_INIT, не зависит ни от размера спирали, ни от размера клубка. Позиционная энтропия спирали длины n в цепи длины N равна k^.ln(N-n). Итого, свободная энергия этой плавающей спирали есть f_INIT - kТ^.ln(N-n). При больших N, член с ln(N-n) всегда доминирует в этом выражении, даже если n ~ 0.9 N; а этот логарифмический член понижает свободную энергию и способствует внедрению спирали в клубок (и, точно так же,  —  клубка в спираль)... Поэтому в одномерной системе фазы не разделяются, они стремятся перемешаться,  —  а раз так, то и фазовый переход первого рода (или типа "все-или-ничего") невозможен  —  при достаточно большой длине цепи. Теорема Ландау доказана.

       Теперь можно поставить вопрос  —   при каких характерных длинах цепи начинается смешение клубковой и спиральной фаз?
       Рассмотрим цепь из N звеньев при температуре "середины перехода", где спираль и клубок имеют равную свободную энергию, т.е. f_EL=0. При этом свободная энергия элонгации спирали (а равно и клубка)  —  ноль, ее инициации  —  f_INIT, а число возможных положений спирали в цепи из N звеньев  —  порядка N²/2 (она может начинаться и кончаться в любом месте при единственном условии, что ее длина  —  не менее трех остатков); и ни расположение спирали в цепи, ни ее длина (при f_EL=0) не влияют на ее свободную энергию. Для получения качественной оценки  —  пренебрежем мелочами (цифрами) по сравнению с главным (буквами). Итак: размещений спирали  —  порядка N², т.е. их энтропия  —  k x 2ln(N), а полная свободная энергия внедрения куска новой фазы (спирали с флуктуирующими концами) в цепь длины N  —  примерно f_INIT - 2kТ^.ln(N). Если она, эта свободная энергия, больше нуля  —  новая фаза не внедрится; если она меньше нуля  —  новая фаза может внедриться неоднократно. Значит, смешение клубковой и спиральной фаз начинается в кусках длины N ~ n₀, а величина n₀ получается из уравнения f_INIT - 2kТ^.ln(n₀) = 0. Итак: характерная длина кусков спирали и клубка в середине перехода
 

n0 = exp(+fINIT/2kТ) = s - 1/2 .

(9.6)

       Точка (температура) середины перехода на опыте находится как та точка, где спиральность очень длинного полипептида составляет 50% (спиральность обычно измеряют при помощи КД спектров, как о том говорилось выше; при 50% спиральности КД спектр полипептида выглядит как полусумма спектров клубкообразного полипептида и полипептида, спирального на 100%). В этой точке f_EL=0, т.е. s = exp(-f_EL/kT) = 1.
       Измеряя в тех же условиях (когда s=1) зависимость спиральности от длины полипептида, можно найти n₀,  —  как ту длину цепи, при которой ее средняя степень спиральности в 4 раза меньше, чем у очень длинной цепи (т.е. чем 50%).
       Точный расчет и доказательство того, что цепь из n₀ = s ^-1/2 звеньев имеет именно (¹/₄) 50% = 12% спиральности при s=1,  —  выходит за рамки нашего курса. Однако получить приблизительную оценку нетрудно. В самом деле, в цепи из n₀ звеньев сумма вероятностей всех состояний, включающих a-спираль, близка  —  по определению — к 50%. А так как состояние "со спиралью" обычно имеет вид типа "клубок_на_одном_конце_цепи  —  спираль  —  клубок_на_другом_конце_цепи", то, в среднем, эта спираль  —  если она есть вообще (а вероятность этого "вообще"  —  50%)  —  включает ¹/₃ звеньев цепи. Итого  —   средняя спиральность цепи из n₀ звеньев приближенно равна 50% x (¹/₃) = 17%.
       Наконец, зная n₀,  —  можно вычислить f_INIT и s. Для большинства аминокислот n₀ » 30, f_INIT » 4 ккал/моль, и s » 0.001.

       Теперь мы можем найти свободную энергию образования водородной связи (вкупе со всеми сопутствующими образованию Р-связи в a-спирали взаимодействиями): согласно (9.2), f_H = -f_INIT/2 » -2 ккал/моль. Можно найти и конформационную энтропию, теряемую при фиксации одного звена в a-спирали: согласно формуле (9.3), TS_a = f_H » 2 ккал/моль.

       Оба параметра стабильности спирали  —  и f_EL, и f_INIT  —  зависят от температуры, но по-настоящему сильно влияет на стабильность спирали именно отклонение величины f_EL от 0. Дело в том, что в спирали, состоящей из ~n₀ звеньев, это отклонение умножается на большое число n₀  —  и уже в таком виде входит в свободную энергию спирали. Когда величина f_ELxn₀/kT составляет порядка +1 (более точная оценка: f_ELxn₀/kT = +2), спиральность практически исчезает, а когда f_ELxn₀/kT = -2,  —  практически исчезает клубок. Значит, при n₀»30, переход спираль-клубок в очень длинных (N>>n₀) полипептидных цепях происходит в области -0.07 < f_EL/kT < 0.07 (Рис.9-2). Это  —  пример резкого, кооперативного,  —   но не фазового (т.к. ширина его не стремится к нулю по мере роста длины цепи) перехода.
 
 
 

       Рис.9-2. Переход спираль-клубок всегда  —  даже для бесконечно длинных цепей  —  имеет конечную ширину. Это  —  пример не фазового, но кооперативного перехода: при малой величине фактора инициации спирали (s<<1) он совершается при совсем небольшом (много меньше, чем на kT) изменении величины f_EL,  —  что показывает, что "единица перехода" кооперирует много звеньев цепи,  —  но отнюдь не всю эту цепь.
 
 

       Для измерения влияния отдельных аминокислотных остатков на стабильность спиралей сейчас чаще всего используются короткие (длиной ~n₀ или менее) полипептиды. В них может образоваться только одна спираль, и оценить влияние каждой аминокислотной замены на спиральность здесь наиболее просто. Сейчас известно, что вклад аминокислотного остатка в стабильность спирали лежит в следующих пределах: аланин; самый "спиралеобразующий" остаток: s » 2, т.е. f_EL » -0.4 ккал/моль; глицин, самый "спиралеразрушающий" остаток: f_EL » +1 ккал/моль, т.е. s » 0.2; правда, у пролина  —  иминокислоты (не имеющей NH группы, которая должна завязывать структурообразующую водородную связь в a-спирали)  —  у него величина s еще много меньше, порядка 0.01  —  0.001, но точно она еще не измерена.
       Ранее аналогичные оценки делались, используя статистические сополимеры (например  —  цепи, включающие случайным образом перемешанные 80% Glu и 20% Ala), и именно так были получены первые  —  а значит, и самые важные оценки, но с появлением возможности синтеза полипептидов с заданной последовательностью  —  такие работы на случайных сополимерах, видимо, отошли в прошлое.
       Используя короткие пептиды с заданной первичной структурой, можно даже оценить влияние на спиральность каждой точечной аминокислотной замены в каждом конкретном месте такого пептида  —  т.е., фактически, в зависимости от расположения аминокислотного остатка относительно N- и С-концов спирали. Боковые группы взаимодействуют с этими концами по-разному  —  в частности, заряженные группы, потому что на N-конце спирали, как уже говорилось, сидят свободные от водородных связей NH-группы главной цепи (и парциальный заряд N-конца a-спирали равен +e/2), а на другом ее конце  —  СО-группы (с суммарным парциальным зарядом в половину электронного,  —  -e/2).
       Кроме того, для измерения стабильности спирального состояния (величины f_EL) в полипептидах, включающих кислотные или оснвные боковые группы (например, в поли(Glu) или поли(Lys)), используется потенциометрическое титрование. Идея этого подхода  —  в том, что заряжая спираль, мы разрушаем ее (т.к. в спирали заряды боковых групп более сближены и потому сильнее расталкиваются),  —  так что стабильность спирали можно рассчитать, зная, как суммарный заряд цепи зависит от рН среды. К сожалению, более подробное рассмотрение этого интересного метода выходит за рамки данного курса.

       Аналогичные подходы применяются и для измерения стабильности b-структуры в полипептидах. Однако они менее развиты, так как b-структура сильно агрегирует. Сейчас стабильность b-структуры часто измеряют прямо в белке  —  путем оценки влияния на его стабильность точечных замен отдельных, лежащих на его поверхности b-структурных аминокислотных остатков. Способность разных остатков стабилизировать b-структуру мы рассмотрим на следующей лекции.

       Рассмотрим теперь скорость образования вторичной структуры в пептидах.

       a-спирали образуются быстро  —  показано, что за десятую долю микросекунды спираль охватывает пептид из 20-30 остатков (для столь быстрых измерений приходится греть раствор пико—  или наносекундным лазерным ударом). Значит, спирали нарастают со скоростью по крайней мере порядка 1 остаток за несколько наносекунд.
       Я сказал "по крайней мере", так как скорость образования спирали зависит не только от скорости, с которой она нарастает, но и от скорости, с которой в цепях появляются первые зародыши спиральной структуры. А инициация спирали требует преодоления активационного барьера  —  и потому образование первого витка спирали требует много больше времени, чем ее последующее удлинение еще на один виток. Так что возможно, что элонгация спирали идет много быстрее, а все наблюдаемое время тратится на ее инициацию. Разберемся в этом вопросе чуть внимательнее.
 
 
 

       Рис.9-3. Характерная зависимость свободной энергии спирали (DF_a) от числа вовлеченных в нее аминокислотных остатков (N) при разных свободных энергиях ее элонгации (f_EL). При f_EL<0  —  длинная спираль стабильна, но ее образование требует инициации,  —  преодоления активационного барьера высотой f_INIT. При f_EL>0  —  спираль любой длины нестабильна и, следовательно, не образуется.
 
 

       Характерная зависимость свободной энергии спирали от ее длины показана на Рис.9-3. Даже когда f_EL<0  —  т.е. когда достаточно длинная спираль стабильна  —   образование первого витка в ней требует преодоления активационного барьера высотой f_INIT. По теории переходных состояний, преодоление такого барьера и образование первого витка в данном месте цепи происходит за время
 

tINIT = t.exp(+fINIT /kT) ,

(9.7)

где t  —  время элементарного шага (в данном случае  —  элонгации спирали на один остаток), а экспонента учитывает малую населенность барьерного состояния. В силу уравнения (9.6)
 

tINIT = t /s.

(9.8)

       Однако инициация может произойти в любой точке спирали, а ее длина  —  порядка n₀ =s ^-1/2. Значит, характерное время инициации первого витка в каком-то месте будущей спирали составляет в n₀ раз меньше времени, а t_INIT/n₀= t/(n₀s) = t /s ^1/2.
       На то, чтобы уже инициированная спираль охватила все свои ~n₀ звеньев, требуется потом примерно то же (что и на инициацию) время, ~tn₀= t/s ^1/2. Значит, все время перехода клубок-спираль в полипептиде должно составлять примерно
 

ta = 2t /s1/2,

(9.9)

и половина, грубо говоря, этого времени идет на инициацию спиралей в разных местах цепи, а половина  —  на элонгацию, протекающую, в согласии с предварительной оценкой, со скоростью порядка 1 остаток за наносекунду.
       Кинетика образования a-спиралей относительно проста: они всегда образуются быстро. Кинетика образования b-структуры много сложнее и интереснее.
       b-структура в полипептидах часто образуется очень медленно  —  за часы, а бывает  —  за недели (хотя бывает, что и за миллисекунду). Почему? И, в то же время,  —  белки с b-структурой сворачиваются не медленнее a-спиральных белков. Как они успевают? И что отвечает за аномалии в образовании b-структуры в полипептидах  —  медленная инициация или медленная элонгация?

       "Аномальная" (по сравнению с переходом спираль-клубок) кинетика образования b-структуры связана с тем, что она  —   двумерный (а не одномерный, как спираль или клубок) объект (Рис.9-4).
 
 
 

       Рис.9-4. (а) Схема b-листа. Аминокислотные остатки внутренних b-участков показаны черными кружками, краевых b-участков  —  пустыми кружками; изгибы (или петли), соединяющие b-участки, изображены в виде уголков. (б) Описанный в тексте сценарий роста b-листа. Самая нестабильная структура помечена значком #.
 
 

       Находящиеся на краю листа звенья цепи имеют меньше контактов с другими, чем внутренние звенья листа. Иными словами, край b-листа (как и граница любой другой фазы  —  например, капли воды, льдинки или a-спирали) имеет повышенную свободную энергию. Однако  —  в отличие от a-спирали (и в сходстве с каплей)  —  b-лист не одномерен, т.е. размер его края (а значит, и его свободная энергия) растет с числом вовлеченных в этот лист звеньев цепи. Поэтому переход клубок  —  b-структура становится фазовым переходом первого рода  —  как образование капли или льдинки. Покажем, что из-за этого на пути образования b-листа возникает высокий (особенно при образовании лишь слегка стабильной b-структуры) свободно-энергетический барьер, который может в миллионы и миллиарды раз замедлить инициацию ее сворачивания.

       Край b-листа сложен из (а) краевых b-тяжей, и (б) изгибов или петель, соединяющих все b-тяжи (Рис.9-4а). Пусть свободная энергия клубка принята за 0 (т.е. за начало отсчета), f_b  —  свободная энергия остатка в центре b-листа, f_b+Df_b  —   свободная энергия остатка на его краю (т.е. Df_b  —  краевой эффект), и U  —  свободная энергия изгиба. Раз b-лист вообще образуется  —  то он стабилен (т.е. f_b <0), а краевые эффекты препятствуют его распаду на кусочки (т.е. Df_b>0 и U>0).
       В кинетике образования b-структуры надо различать два случая:
       А) f_b+Df_b<0, т.е. длинная b-шпилька сама по себе стабильнее клубка. Тогда только образование изгиба в вершине этой шпильки требует преодоления активационного барьера (примерно такого же, как при образовании a-спирали), а дальнейший рост b-структуры идет быстро  —  примерно как элонгация a-спирали (см. линию с f_EL<0 на Рис.9-3).
       Б) f_b+Df_b>0, т.е. b-шпилька сама по себе нестабильна, и только прилипание к инициирующей b-шпильке последующих b- тяжей стабилизует b-лист. Активационному барьеру тогда соответствует образование "зародыша"  —  такого b-листа или b-шпильки, что дальнейший рост листа пойдет уже с общим понижением свободной энергии.
       Образование и последующее "прорастание" зародыша новой фазы  —  характернейшая особенность фазовых переходов первого рода, к коим принадлежит и образование b-структуры. Однако преодоление связанного с образованием зародыша активационного барьера, как мы скоро убедимся, может быть очень и очень медленным.

       Рассмотрим следующий простейший сценарий роста стабильного b-листа (Рис.9-4б): образование инициирующей b-шпильки из изгиба и двух b-тяжей, по N звеньев (аминокислот) в каждом; образование последующего изгиба на ее конце; прилипание к листу b-тяжа из N звеньев; образование последующего изгиба; прилипание b-тяжа; и так далее.
       Возникновение  —  из клубка  —  b-шпильки из изгиба и двух N-звенных b-тяжей повышает свободную энергию цепи на U+2N(f_b+Df_b); образование последующего b-изгиба повышает ее еще на U. Прилипание к N-звенному краю этой шпильки N-звенного b-тяжа снижает свободную энергию на Nf_b (ведь при этом число краевых звеньев не меняется, а число внутренних растет на N); образование последующего b-изгиба опять повышает свободную энергию на U; прилипание нового N-звенного b-тяжа снова понижает ее на Nf_b, и т.д.
       Цикл "прилипание нового b-тяжа и образование нового b-изгиба" изменяет суммарную свободную энергию на Nf_b+U. А так как в результате такого цикла свободная энергия должна снижаться (только тогда сворачивание цепи пойдет быстро), то прилипающий b-тяж (а равно и тот, к которому он прилипает) должен состоять не менее чем из N_min = U/(-f_b) звеньев.
       "Переходным", т.е. самым нестабильным состоянием по ходу образования b-структуры является (по нашему сценарию) b-шпилька с последующим изгибом. Так как стабильность шпильки падает с удлинением, а b-тяж в инициирующей шпильке должен состоять как минимум из N_min звеньев, то минимальная свободная энергия инициирующей b-шпильки составляет
 

F# = U+2Nmin(fb+Dfb)+U = 2(UDfb)/(-fb).

(9.10)

       Это  —  свободная энергия переходного состояния при образовании b-листа по нашему сценарию. Теперь осталось только показать, что, какой сценарий ни возьми, существенно более стабильных переходных состояний быть не может.

       Чтобы показать это  —  оценим, как будет меняться минимальная свободная энергия b-листа с его увеличением. Общий ход изменения показан на Рис.9-5. Пока лист мал, доминируют краевые эффекты, и свободная энергия повышается. В большом же листе доминируют внутренние остатки, и его свободная энергия падает.
 
 
 

       Рис.9-5. Общий ход изменения F_opt, минимальной свободной энергии b-листа, с увеличением числа М звеньев в нем. Кривые относятся к разным свободным энергиям f_b внутренних звеньев b-листа. #  —  точка максимума величины F_opt по ходу роста b-листа. При росте b-листа (в отличие от роста a-спирали, см. Рис.9-3) максимум его свободной энергии не приходится на самое начало этого процесса.
 
 

       Теперь перейдем к расчетам. Сначала оценим минимальную свободную энергию M-звенного b-листа. Свободная энергия листа, состоящего из m b-тяжей (равной длины, чтобы минимизировать краевую свободную энергию) и m-1 изгиба, равна
 

F(M,m) = Mfb + 2(M/m)Dfb + (m-1)U

(9.11)

       Варьируя число b-участков m, найдем минимум этой свободной энергии из условия
 

dF/dm =  -2(M/m2)Dfb + U = 0.

(9.12)

       Отсюда следует оптимальное число b-участков в этом листе, m_opt = M^1/2 [2Df_b/U]^1/2 и его свободная энергия, F_opt(M) = F(M,m_opt) = Mf_b -  U + 2 M^1/2 [2Df_b^.U]^1/2. Варьируя величину F_opt(M) по M, находим ее максимум (см. Рис.9-5) из условия
 

dFopt/dM = fb + M-1/2 [2Dfb.U]1/2 = 0.

(9.13)

       Далее можно определить размер b-листа, соответствующего этому максимуму, M^* = 2(Df_b^.U)/(-f_b)², и его свободную энергию
 

F* = Fopt(M* ) = 2(Dfb.U)/(-fb)  —  U.

(9.14)

       Величины F^* и F^# (см. формулу 9.10) совпадают в главном члене, 2(Df_b^.U)/(-f_b). Именно из-за него свободная энергия перехдного состояния F^# всегда велика, когда свободная энергия стабилизации b-структуры (-f_b) мала, т.е. когда b структура находится на грани стабильности. В сущности, F^# стремится к бесконечности, когда b структура приближается к термодинамическому равновесию с клубком, т.е. когда (-f_b) ® 0.

       Так как, согласно теории переходного состояния, время процесса t зависит от свободной энергии переходного (самого нестабильного промежуточного) состояния F^# как
 

tb ~ tb.exp(+F#/kT),

(9.15)

где t_b  —  время элементарного шага (в данном случае  —  элонгации b-листа на один остаток; и нет причин, чтобы скорость элонгации b-листа качественно отличалась бы от скорости элонгации спирали), то характерное время образования b листа, при малых -f_b, есть
 

tb ~ tb.exp[A/(-fb)] ,

(9.16)

где A  —  некая константа. Каково бы ни было ее численное значение,  —  видно (см. Рис.9-6), что при малых -f_b время образования b структуры будет огромно (в пределе  —  бесконечно велико).
 
 
 

       Рис.9-6. Общий вид зависимости характерного времени образования b-листа от стабильности b-структуры.
 
 

       Итак: малостабильная b-структура (а именно она наблюдается в неагрегирующих полипептидах) должна образовываться очень медленно,  —  и причина здесь не в медленной элонгации, а в медленной инициации  —  трудно собрать свободную энергию из теплового движения и преодолеть высокий барьер.
       Так объясняется и экспериментально наблюдаемая, очень медленная скорость образования b-структуры в неагрегирующих полипептидах, и резкий ее рост с повышением стабильности b-структуры.
       В то же время стабильные b-листы и шпильки (а именно они и наблюдаются в белках) должны образовываться довольно быстро  —  примерно как a-спираль.

       Крайне медленная инициация  —   общее свойство фазовых переходов первого рода, когда возникающая фаза находится на грани стабильности. Вспомните: переохлажденная жидкость, перегретый пар... Все это связано с большой свободной энергией обширной граница раздела фаз. А b-структура как раз и образуется фазовым переходом первого рода  —   со всеми вытекающими последствиями...
       Наоборот, a-спираль не образуется фазовым переходом первого рода [вспомните: граница спирали, в отличие от границы b-структуры (или льдинки), не растет с ее размером]  —   поэтому барьер, который нужно преодолеть при сворачивании спирали, всегда имеет конечную (и небольшую) величину, и она может успеть "проинициироваться" за микросекунду.

       Заключительное замечание: что такое "клубок". Этим термином я много раз пользовался, говоря о цепи, не имеющей определенной структуры. Действительно, клубок не имеет никакого дальнего порядка  —  что, однако, не исключает слабый (на масштабе всего нескольких подряд идущих звеньев цепи) ближний порядок.
       Самой интересной особенностью клубка (экспериментально наблюдаемой с помощью гидродинамических методов, при помощи рассеяния света и рентгеновских лучей) является его крайне малая плотность и совершенно особая зависимость его размеров  —  радиуса и объема  —  от длины цепи.

       Для выяснения этой особенности, рассмотрим простейшую модель клубка, так называемую "свободно-сочлененную цепь" (Рис.9-7). Она состоит из звеньев-"палочек"; "звено" может включать в себя несколько мономеров полимерной цепи; главное  —  что каждая "палочка" может свободно, как угодно поворачиваться в сочленении относительно своих соседей по цепи. Пусть в цепи M "палочек", и длина каждой равна r.
 
 
 

       Рис.9-7. Свободно-сочлененная цепь  —  модель клубка.
 
 
 

       Такую цепь можно описать как цепочку из векторов r₁, r₂ ,..., r_M (напомню: вектор в математике  —  это отрезок прямой, имеющий направление). Эти вектора имеют одинаковую длину r, и каждый из них направлен от предыдущего сочленения к последующему. Сумма векторов
 

(9.17)

есть просто вектор, идущий от начала к концу цепи. Квадрат длины этого вектора есть
 

(9.18)

       Найдем теперь среднюю величину <h²>, т.е. усредним h² по всем возможным тепловым флуктуациям цепи. При этом мы должны учесть, что <r_i²>, средний квадрат вектора r_i, есть просто r², а среднее произведение любых векторов <r_ir_j> есть 0 при i№j, так как, свободно вращаясь, эти вектора имеют ту же вероятность быть направленными что в одну, что в разные стороны.
       Значит, средний квадрат расстояния между концами свободно-сочлененной цепи есть
 

(9.19)

то есть линейные размеры (радиус и т.д.) клубка растут с ростом числа M звеньев в цепи как M^1/2. Отсюда следует, что объем клубка пропорционален M^3/2  —  в то время как для всех "нормальных" (имеющих фиксированную плотность) тел объем растет только как число частиц M,  —  т.е. гораздо медленнее, чем M^3/2. Такая аномально сильная зависимость объема клубка от размера цепи и есть самое характерное свойство клубка. Из него, в частности, вытекает крайне низкая плотность клубка, образованного длинными цепями, и, как следствие  —  практическое отсутствие контактов между дальними по цепи звеньями.
       Недостаток, недостаточная реалистичность свободно-сочлененной модели  —  в том, что она рисует клубок в сильно идеализированном виде, т.к. допускает, что в любом своем звене цепь может поворачиваться на любой угол,  —  а это, вообще говоря, не так. Однако формулу (9.19) можно переписать в более общем виде,
 

<h2> = Lr ,

(9.20)

где L = Mr   —  полная ("контурная") длина цепи, пропорциональная числу звеньев в ней, а r  —  эффективное расстояние между "свободными сочленениями" цепи, т.е. характерная длина, на которой цепь "забывает" о своем направлении (для справки: в полипептидной цепи эта характерная длина  —  или, как говорят, "длина Куновского сегмента"  —  составляет 30 — 40, т.е. Куновский сегмент такой цепи содержит около 10 аминокислотных остатков). В виде (9.20) формула, описывающая размер клубка, уже обретает достаточную общность и может применяться для описания реальных полимеров.