ЭЛЕМЕНТАРНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В БЕЛКАХ И ВОКРУГ

    Лекция 2

           Аминокислоты, из которых сложена полипептидная цепь (Рис.2-1), могут находиться в двух стерических формах: L и D.
     
     
     

           Рис.2-1. Боковые цепи двадцати стандартных аминокислотных остатков, исходящие из Сa атомов главной цепи. Белыми кружками показаны Сa атомы главной цепи, серыми  -  С атомы боковых групп, светло-серыми  -  H атомы боковых групп, синими  -  N атомы боковых групп, красными  -  O атомы боковых групп, желтыми  -  S атомы боковых групп.
     
     

           Эти формы, L и D, зеркально-симметричны: в них массивный боковой радикал (R) и Н-атом, стоящие при a-углероде (Сa) аминокислоты, меняются местами (стрелки указывают углубление атомов в рисунок):

    L и D форм нет только у глицина (Gly), "боковая цепь" которого состоит лишь из Н-атома.
           Белковые цепи сложены только из остатков L-аминокислот. Только они кодируются генами. D-аминокислотные остатки  -  они встречаются в пептидах  -  не кодируются при матричном синтезе белка, а синтезируются специальными ферментами. Рацемизация (L ' D переход) спонтанно в белках практически не происходит. Не происходит она и при биосинтезе,  -  хотя часто встречается при чисто химическом синтезе пептидов, где на борьбу с рацемизацией уходит много сил.
           Аминокислоты в белковой цепи связаны между собой пептидными связями C' и N атомов (Рис.2-2).
     
     
     

           Рис.2-2. Полипептид: главная цепь и боковая группа (Ser) на ней. Пептидные группы заштрихованы. Показаны углы внутреннего вращения в главной (f, y, w) и боковой (c) цепях. Стрелки указывают направление вращения, ведущее к росту угла поворота ближней к нам части цепи относительно более отдаленной ее части. Картинка взята из [3] и адаптирована.
     
     

           Важную роль в структуре белка играет как жесткость этих связей, так и плоская форма всей пептидной группировки
     

           И то, и другое обеспечивается так называемой sp2-гибридизацией электронов N и С' атомов. "Гибридизация" электронных орбит  -  это чисто квантовый эффект. Sp2-гибридизация преобразует одну сферическую s-   и две вытянутые p-орбиты электронов атома в три sp2-орбиты. Эти три орбиты вовлекают атом в три ковалентные связи, лежащие в одной плоскости (-·<). Вовлеченные в sp2-гибридизацию электроны ковалентно связанных C' и N атомов создают "делокализованное" электронное облако, охватывающее оба эти атома, и распространяющиеся также  -  через связь С-О  -  на атом О (именно поэтому связи C'N и CO рисуются как равноправные "полуторные", ). Но у C и N атомов есть еще p-электроны кроме тех, что уже задействованных в sp2 орбитах! И так как эти p-орбиты имеют форму "восьмерок", перпендикулярных всем трем sp2-орбитам (-·<), то дополнительная связь этих p-электронов  -  связь, требующая сближения "восьмерочных" орбит и "обобществления" (т.е. переходов с атома на атом) находящихся на них электронов,
     

      -  это обобществление p-электронов препятствует вращению вокруг С'-N связи.

           Хочу напомнить, что делокализация электронов, их переход с атома на атом  -  основная причина образования химических связей. Это следует из принципа неопределенности Гайзенберга:
     
    DpDx '  (2.1)

    Здесь Dp  -  неопределенность в импульсе частицы, Dx - неопределенность в ее координате, а  ? h/2p, где h -  постоянная Планка. Так как направление движения электрона в атоме не может быть известно, то Dp ' |p| = mv, где v  -  скорость, а m  -  масса частицы. Следовательно,
     

    v ' /(mDx) .         

           В то же время, кинетическая энергия частицы E = mv2/2, т.е.
     
    E ' 2/(mDx2).  (2.2)

           Следовательно, при делокализации, когда Dx возрастает,  -  энергия частицы падает, и она переходит в более стабильное состояние. Видно, что этот эффект наиболее силен для легких частиц  -  т.е. электронов. Так делокализация электрона приводит к химической связи.

           Длина химической связи близка к Вандерваальсову радиусу атома, т.е. составляет 1  -  2 (точнее: около 1   -  для связи C-H, N-H или O-H, около 1.2  -  1.3   -  для С=О, CO, CN и С=С, 1.5   -  для С-С, и около 1.8   -  для S-S).

           Характерные величины валентных углов составляют около 120о и около 109о. Углы в 120о находятся при sp2-гибридизованных атомах типа -C'<, -N<, где три валентные связи направлены из центра к вершинам плоского треугольника, углы в 109о  -  при sp3-гибридизованных атомах типа >Ca<, где четыре связи направлены из центра к вершинам тетраэдра, а также при завязывающих по две связи O< или S< атомах.

           Остановимся теперь на характерных величинах флуктуаций, т.е. тепловых колебаний валентных связей и углов. Они могут вносить вклад в гибкость белковой цепи.

           Частоты колебаний проявляются в инфракрасных (ИК) спектрах белков. Характерные частоты колебаний таковы:  n ~ 7x1013 сек-1  -  для колебания атома Н,  -  например, в С-Н связи (при этом длина волны l=c/n~5мк); и n ~ 2x1013 сек-1  -  для колебания "тяжелых" групп,  -  например, в СН3-СН3 связи (при этом l=c/n~15мк; здесь c  -  скорость света, 300000 км/сек).

           Возбуждены ли эти колебания теплом при комнатной температуре?

           Для ответа на этот вопрос мы должны сравнить тепловую энергию, приходящуюся на одну степень свободы ("тепловой квант" kT) с энергией колебания. Оценим величину kT при "нормальной" температуре. Здесь T  -  абсолютная температура в градусах Кельвина (Т=300оК при 27оС, т.е. при примерно "комнатной" температуре; К  -  обозначение градуса Кельвина), а k (иногда еще пишут kB) -  постоянная Больцмана [равная 2 (кал/моль)/К, или 0.33x10-23 кал/К в расчете на одну частицу, так как в одном моле  -  6x1023 частиц]. Значит, при комнатной температуре "тепловой квант" kT = 600 кал/моль, или (600кал)/(6x1023 частиц), т.е. 10-21 калорий на частицу.
           Соответствующую такому тепловому кванту частоту nT можно найти из соотношения kT = hnT [где постоянная Планка h?2p=6.6x10-34 Джxсек = 1.6x10-34 калxсек; напомню, что 1 калория (кал) = 4.2 джоуля (Дж)]. Итак, частота nT равна 7x1012 сек-1 при T=300K, т.е. при 27оС.
           "Тепловой квант" не может возбудить более жесткие, более частые, чем он сам, колебания.
           Значит, при комнатной температуре валентные связи "тверды" и не флуктуируют: для этих связей частота колебаний n ~ 2x1013  -  7x1013 сек-1, т.е. она на порядок больше, чем nT = 7x1012 Джxсек-1.
           Однако валентные связи могут раскачиваться падающим инфракрасным светом, и на этом основана ИК-спектроскопия белков. Собственно, именно ИК спектроскопия и дает сведения о колебаниях атомов, валентных связей и валентных углов. Конечно, экспериментально их исследуют на малых молекулах, а затем полученную информацию используют при изучении белков.
           В отличие от колебаний длин связей, тепловые колебания валентных углов, на порядок более мягкие,  -  их частоты лежат в пределах 1012  -  1013 сек-1,  -  возбуждены при комнатной температуре. Однако их характерная амплитуда невелика  -  около 5о.

           Итак, колебания валентных связей вовсе не вносят вклада в гибкость белковой цепи, а колебания валентных углов вносят весьма скромный вклад. На самом деле гибкость белковой цепи, а значит -   и ее способность складываться и в a спирали, и в глобулы обеспечивается вращением (хотя и не вполне свободным вращением, см. ниже) вокруг валентных связей. Поэтому и структура цепи в целом часто описывается просто в терминах углов вращения вокруг валентных связей  -  тогда она называется "конформацией". Впрочем, очень часто термины "структура" и "конформация" употребляются просто как синонимы.

           Основные сведения о вращении атомных группировок вокруг валентных связей тоже поставляет ИК-спектроскопия; как и раньше, я остановлюсь только на результатах.
           Взаимное расположение атомных группировок, связанных валентной связью, описывается двугранным углом (двугранным  -  так как это угол между двумя плоскостями  -  "гранями"). Рисунки 2-2, 2-3 иллюстрируют отсчет этого угла. Отсчет  -   такой же, как в школьной тригонометрии, если рассматривать ближнюю к нам валентную связь как "вращающуюся стрелку", дальнюю от нас  -  как "координатную ось", а центральную валентную связь  -  как "ось вращения". То есть вращение "стрелки" против хода часов увеличивает угол поворота, а по ходу  -  уменьшает.
     
     
     


           Рис.2-3. Отсчет величины двугранного угла (угла поворота): вид поперек (слева) и вдоль (справа) оси вращения. Дальняя от нас валентная связь 0''- c   -   "ось координатного круга", центральная связь 0'- 0''   -   "ось вращения", ближняя к нам связь 0'- a   -   "стрелка на координатном круге".
     
     

           Рисунок 2-4 показывает характерное поведение энергии при вращении вокруг связи, соединяющей два sp3-гибридизованных атома (на примере Н3С-СН3 и СН2С-СН2С связей). Такие связи характерны для алифатических боковых групп. Углы вращения боковых групп называются углами w, "хи" (см. Рис.2-2). Максимумы такого трехкратного (соответственно симметрии sp3-sp3 связи) потенциала (т.е. потенциала, имеющего три максимума и три минимума при повороте на 360o) соответствуют трем "затененным" конформациям (0о, +120о и -120о), приводящим к сближению (и отталкиванию) электронных облаков. Эти облака отталкиваются, так как образующие их электроны уже задействованы в ковалентных связях. Величина возникающих при этом потенциальных барьеров вращения вокруг Н3С-СН3 связи  -  около 3 ккал/моль, а характерный размах тепловых флуктуаций вокруг этих минимумов (т.е. те отклонения от них, при которых энергия возрастает на kT)  -  15-20о.
     
     
     

           Рис.2-4. Характерный потенциал вращения вокруг одинарной связи между двумя sp3-гибридизованными атомами: вокруг Н3С-СН3 связи (красная кривая) и вокруг (С-СН2)-(СН2-С) связи (синяя кривая). Главный энергетический эффект дает отталкивание электронных облаков: оно максимально в "затененной" конформации (при 0, 120, 240о) и минимально в "скрещенной" (при 60, 180, 300о). Отталкивание маленьких Н-атомов несущественно. Однако отталкивание тяжелых, окруженных большими электронными облаками С-атомов в окрестности 0о создает добавочный энергетический эффект, отличающий поворот вокруг (С-СН2)-(СН2-С)связи от поворота вокруг (Н3С)-(СН3) связи. Для сравнения, стрелкой  отмечена величина kT.
     
     

           Когда некоторые из валентностей при sp3 гибридизованных атомах заняты не водородами, а более массивными атомами  -  их отталкивание повышает соответствующую слишком тесному сближению этих массивных атомов часть барьера. Это показано на Рис.2-4 на примере вращения вокруг центральной связи в (С-СН2)-(СН2-С).
           Рисунок 2-5 показывает характерное поведение энергии при вращении вокруг пептидной связи, соединяющей два sp2-гибридизованных атома (С' и N). Угол вращения вокруг этой связи называется углом w (Рис.2-2). Потенциал двукратен (т.е. имеет два максимума и два минимума при повороте на 360o), соответственно симметрии sp2-sp2 связи. Потенциальные барьеры велики из-за участия в пептидной связи p-электронов (как о том говорилось в начале лекции), минимумы потенциала приходятся на 0o и 180o (где p-орбиты, стягивающие С'- и N-атомы, наиболее сближены), а его максимумы  -  на 90o и 270o (где эти стягивающие p-орбиты наименее сближены и, следовательно, хуже всего связаны друг с другом). Из-за высоких барьеров характерный размах тепловых флуктуаций угла вращения вокруг таких связей невелик  -  около 10о.
     
     
     

           Рис.2-5. Характерный потенциал вращения вокруг кратной связи, соединяющей два sp2-гибридизованных атома (С' и N) в пептидной связи. Справа показана связь электронных p-орбит при угле, равном 0o (или 180o). Для всех (за исключением пред-пролиновых) пептидных связей энергия (красная кривая) при 0о выше, чем при 180о, из-за отталкивания массивных Ca-атомов. Эта разность энергий мала для пептидной связи, находящейся перед Pro (синяя кривая), имеющим не один, а два С-атома при N-атоме. См. текст и рисунок, где приведена структурая формула пролина.
     
     

           Стоит отметить, что отталкивание массивных Ca атомов делает cis конформацию (w=0о) энергетически довольно невыгодной; поэтому почти все пептидные группы в белках находятся в trans конформации (w=180о).
     

           Исключение составляет пептидная связь, предшествующая пролину (имино-, а не аминокислоте): в Pro  -  два почти симметричных массивных радикала при N атоме (-СaНС2 и -СН2С, см. Рис.2-1), так что для этой связи trans конформация лишь ненамного лучше, чем cis.
     

           И в глобулярных белках, и в развернутых (т.е. флуктуирующих, не имеющих фиксированной структуры) пептидах наблюдается около 90% trans и 10% cis пролинов. Хочу обратить ваше внимание на эту закономерность  -  что выгодно само по себе, то чаще встречается и в глобулярных белках. Мы столкнемся с ней еще не раз.

           Наконец, рассмотрим потенциал вращения вокруг связи, соединяющей sp3 гибридизованный и sp2 гибридизованный атомы. Углы вращения вокруг такой связи называются углами f (вращение вокруг N-Ca связи) и y (вращение вокруг Ca-С' связи) (Рис.2-2). При вращении по каждому из них возникает шестикратный (6 минимумов и 6 максимумов при повороте на 360o) потенциал с довольно низкими барьерами (Рис.2-6): их высота, '1 ккал/моль  -  порядка энергии тепловых колебаний (составляющей, как мы помним, 0.6 ккал/моль при комнатной температуре). Именно почти свободное вращение по углам f и y вокруг такого рода связей (между N и Сa и между Ca и C') в главной цепи полипептида и обеспечивает основную гибкость белковой цепи.
     
     
     

           Рис.2-6. Характерный потенциал вращения вокруг одинарной связи между sp3- и sp2-гибридизованными атомами (на примере вращения вокруг Н3С-С5Н6 связи).